水产品中氯霉素和己烯雌酚快速检测方法初探

易 鸣 朱志强 曾 智

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水产品中氯霉素和己烯雌酚快速检测方法初探

易 鸣 朱志强 曾 智

在标准《NY 5070-2002 无公害食品水产品中渔药残留限量》中氯霉素和己烯雌酚因其对人体的危害已被列为不得检出的药物残留项目。检测氯霉素和己烯雌酚的方法主要有酶联免疫法、气相法、液质联用法，其中酶联免疫法耗时最短且操作最简单，也是笔者检测工作的主要项目之一。结合笔者的实际工作，本文详述了酶联免疫法测定水产品中氯霉素和己烯雌酚含量的原理、方法和注意事项。

一、材料和方法

1.氯霉素和己烯雌酚

氯霉素属抑菌性广谱抗生素，能对多种细菌微生物产生作用，常用于对水生动物各种传染病的治疗，曾在水产养殖业中得到广泛应用，同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。因其会引起人类的再生障碍性贫血、新生儿灰婴综合症等严重毒副作用，作为渔药已禁用。己烯雌酚为人工合成的非甾体雌激素，对水生动物有提高繁育率等作用。但人食用了残留有己烯雌酚的水产品后会造成体内激素失调，对人体健康产生危害，作为渔药也已禁用。因此对水产品中氯霉素和己烯雌酚的检测对于食品安全有重要意义。

2.酶联免疫法

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）。它的中心原理就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。

具体步骤是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，然后与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。但由于酶联免疫法可能出现假阳性情况，故在本法检出阳性后一般再用其它方法复验。

3.酶联免疫试剂盒

试剂盒中提供的检测材料有：酶标板、标准品、酶结合物、抗体、底物溶液、终止液和洗涤液、提取液等试剂。

（1）氯霉素酶联免疫试剂盒

笔者在实际工作中使用氯霉素酶联免疫试剂盒检测时采用间接竞争一步法。在酶标板中同时加入标准品（或样本）、酶标二抗及氯霉素抗体，酶标板上包被的抗原与加入的标准品（或样本）中的抗原竞争结合加入的氯霉素抗体，同时酶标二抗与氯霉素抗体结合。用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物中氯霉素浓度呈负相关，与校准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中氯霉素的含量。

（2）己烯雌酚酶联免疫试剂盒

笔者在实际工作中所用的己烯雌酚酶联免疫试剂盒基于竞争性酶联免疫反应原理。含有己烯雌酚的抗原已经包被于微孔板上。检测时，样品同特异性一抗共同被添加到板孔中，如果样品中含有己烯雌酚，会竞争一抗，抑制抗体与板上包被的药物抗原结合。加入酶标记的二抗，形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物。加入底物后，产物的颜色深浅与样品中己烯雌酚的浓度成反比。

二、样品前处理

由于上酶标板检测必须采用液体样本，所以必须对样品进行前处理，提取出其中的氯霉素和己烯雌酚。因两种药残的样品前处理步骤大同小异，以下以氯霉素的前处理为主，合并叙述。以笔者在工作中采用的试剂盒为例，所有的提取液、洗涤液等均需预先配成1倍浓度。

（1）称取3.0±0.05g（己烯雌酚称取2.0g）组织样本于50mL离心管中；

（2）加入6mL乙酸乙酯（己烯雌酚加6mL乙腈和2mL组织提取液）；

（3）涡漩3-5分钟；

（4）4000转离心10分钟，取4mL有机相（己烯雌酚取3mL有机相至另一试管中加入150mg组织清洗剂，涡漩30秒，室温静置5分钟，再次4000转离心10分钟后取2.4mL上清液），于60℃下氮气吹干；

（5）残留物加入1mL正己烷和1mL样本稀释液（己烯雌酚加入400µL1倍PBS-甲醇（3∶2，v/v），涡漩混匀1分钟；

（6）取50µL下层液体（己烯雌酚为均相液体）进行检测。

三、操作步骤与要点

此为定性定量的关键步骤，但由于两种试剂盒的操作步骤不尽相同，以下分别叙述。

1.氯霉素试剂盒操作步骤

①加样：每孔加入标准品或样品50µL，加入酶结合物50µL和抗体50µL，轻轻震荡混匀，25℃静置温育30分钟。

②洗板：取出微孔板，甩干孔内液体，用洗涤液洗板4次，250µL/孔，浸泡30秒，在吸水纸上拍干。

③显色：每孔加入底物溶液100µL，震荡后25℃避光显色15分钟。

④依序每孔加终止液50µL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

⑤在加终止液后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光度（OD）值。

2.己烯雌酚试剂盒操作步骤

①每孔加入标准品或样品50µL和一抗100µL轻轻震荡混匀，25℃静置反应30分钟。

②洗板，同氯霉素试剂盒操作步骤（2）。

③每孔加入150µL二抗，25℃避光显色30分钟。

④洗板，同步骤（2）。

⑤加入100µLTMD底物并混匀，25℃避光静置反应10-15分钟。

⑥每孔加终止液100µL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

⑦稳定2分钟后，在450nm波长下测定OD值。

3.操作要点

由于同属酶联免疫试剂盒，其操作有共同之处。现将操作要点一并叙述如下：

（1）为保证抗体活性，试剂盒应保存在2-8℃下，使用前将盒内试剂移至室温25℃平衡至少30分钟。整个酶标板操作过程都应保证温度在25℃左右。按量取用微孔条，不用的放回铝箔袋，2-8℃保存。

（2）加样：加样使用一次性枪头，避免交叉污染。加样时应轻缓，避免起泡，直接加于酶标板底部，勿沿孔壁加样。一次加样时间最好控制在10分钟内，如样品数量多，在可能时推荐使用排枪加样。

（3）温育：为防止样品蒸发或污染，温育过程中推荐覆上板贴。温育过程中应保持温度恒定，室温达不到25℃时推荐使用空调，可在已恒温的小盒子内温育。

图1 Mk3型酶标仪给出的数据

（4）洗板：洗板过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。ELISA分析中的重现性很大程度上取决于洗板的一致性。手工洗板法：吸去（不可触及孔壁和孔底）或甩掉酶标板内液体；在实验台上铺几层吸水纸，酶标板向上用力拍几次；浸泡时间不可太短，以30秒为宜；重复次数以4次为宜。自动洗板法：如有自动洗板机，就在熟练使用后再用到正式实验中去。

（5）显色：为保证实验结果的准确性，底物显色反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间（如每隔10分钟）观察显色情况以控制反应时间。当肉眼可见标准品前1-4孔有明显梯度蓝色，后5-6孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应与底物溶液加入顺序相同。

（6）底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则应弃用。底物溶液易受污染，应避光保存。

（7）试剂盒的最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光值和灵敏度发生变化。

四、数据处理

以氯霉素的数据处理为例说明酶联免疫法的数据处理。

笔者使用的是热电Mk3型酶标仪。给出的数据如图1：其中A1、B1、C1、D1、E1、F1格为标准曲线OD值，G1-H3为样品OD值。

图2 在计算软件上输入的测定值

图3 由OD值计算出的标准曲线图形

笔者在实际工作中使用RIDARSOFT Win (Art.No.Z9999软件)计算，输入界面如图2，其中上半部分为指定标准品和样品，下半部分为标准品和样品的OD值。

计算出的标准曲线如图3。

计算出的结果如图4，样品的稀释倍数为0.5。

图4 计算结果

五、结果分析

对标准曲线进行分析：OD值有明显的梯度，图形呈曲线，判断标准曲线合格。软件自动分析18号样品OD值超出标准曲线范围；对样品值进行分析：1号样品和18号样品OD值接近或超过标准点最低浓度，判断为样品氯霉素含量极低，属正常现象。

六、结论

水产品中氯霉素和己烯雌酚的检测对现时的食品安全有重要意义，酶联免疫法作为一种快速检测方法在实际应用中更有潜力。因相对其它检测方法操作简单、快速而节省了实验室的时间、人力，提高了检测效率。通常农业部一次例行监测约50个样品用酶联免疫法检测氯霉素只需要1-2天即可给出结果，但如何避免假阳性，还需进一步研究。

（通联：430077，湖北省水产科学研究所）