Bh类孟买血型的分子机制研究

王 芳,毛 伟,张 涛,刘不尽,廖红梅,李 维

(重庆市血液中心,重庆400015)

Bh类孟买血型的分子机制研究

王 芳,毛 伟,张 涛,刘不尽,廖红梅,李 维

(重庆市血液中心,重庆400015)

目的 研究并探讨1例Bh类孟买血型血清学特点和分子机制。方法 通过血清学的方法鉴定为类孟买血型，采用SSP方法进行ABO血型基因型的确认，采用SBT方法对FUT1基因序列进行分析，确认基因突变的位置。结果 血清学结果确认为Bh分泌型，ABO基因型为O01/B101,FUT1直接测序结果显示在nt661处存在有1处错义突变即C->T，导致221位氨基酸由精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)。结论 FUT1第4外显子编码区的错义突变即nt661处C->T，使221位的精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)，这个突变型是第36个FUT1突变型，表现为红细胞H抗原弱表达的类孟买血型，这一种突变型中国人群中为首次报道。

类孟买血型;分子机制;FUT1基因

(ChinJLabDiagn,2017,21:1249)

红细胞血型系统非常复杂，截止到2016年8月国际输血协会(ISBT)命名发布的红细胞血型系统共有36个，临床上除ABO和RH血型系统外最重要的血型系统是第18个血型系统(H血型系统又称孟买血型系统)，只有1个H抗原受控于FUT1基因。H抗原是ABO血型和Lewis血型等的前体物质[1]，在人体中有2种存在形式：一种是存在于人类红细胞等组织细胞膜上的脂溶性H抗原受控于FUT1基因(H)编码的α-1,2-岩藻糖转移酶(H enzyme)的作用，另一种存在于体液、分泌液中的水溶性H抗原受控于FUT2基因(或Se)编码的α-1,2-岩藻糖转移酶 (Se enzyme)的作用，当FUT1和或FUT2基因突变，会导致H抗原的部分或者全部缺失，产生孟买型和类孟买血型两种稀有血型[2,3]。为了进一步了解本地区类孟买血型的血清学特点并进一步阐明类孟买血型的分子机制，我们对本地区一例类孟买血型Bh分泌型进行了分子机制研究，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 对象 健康男性，28岁，汉族，在医院健康检查时，因血型正反定型不符，医院无法判断血型，该名男性到血液中心输血研究所采集抗凝血液5 ml和唾液标本3 ml，经过血型血清学鉴定和分子生物学的检测，确定该名男性血型为类孟买血型Bh分泌型。

1.2 试剂和方法

1.2.1 血清学检测 抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体、抗H单克隆抗体、人反定型用红细胞试剂、A2细胞(由上海血液生物医药有限公司)，抗-Lea 、抗-Leb(美国Immuncor公司)，抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体(长春博德生物制品有限公司)，人源抗A、抗B抗体、抗AB抗体(中国医学科学院成都输血研究所)。A B O 血型鉴定、唾液中 ABH 血型物质测定试验、Lewis 血型鉴定按照相关试剂说明书及《全国临床检验操作规程》进行操作。

1.2.2 基因检测 ①DNA提取试剂 用Puregene Blood Core Kit B DNA提取试剂(德国Qiagen公司)，提取EDTA-K2抗凝全血标本中基因组DNA。浓度大于20 ng/μL，260/280比值在1.6～1.9的标本可用于检测，按照试剂盒说明书进行操作。②ABO血型基因SSP检测 采用ABO-TYPE SSP基因分型试剂盒(德国BAG公司)，将提取的符合实验条件的DNA，按基因分型试剂盒说明书进行操作。③FUT1基因测序分析 FUT1基因扩增和测序引物参照FUT1基因序列，采用计算机辅助设计、上海申能博彩公司合成。按文献[4]的方法进行扩增、电泳、克隆和直接测序分析。

1.3 设备 Gene Quant Pro型DNA 浓度测定仪(英国)，ABI3730型基因测序仪和ABI PE9700型扩增仪(美国) POWER PAC 3000型电泳仪(美国)，KST-5500型凝胶成像分析系统(北京东迅)、血型血清学离心机 KA -2200 SEROMAMTIC II(日本KUBOTA)

2 结果

2.1 血清学结果 这名健康男性的血清学检测结果见表1、表2，通过反应格局综合分析，这名健康男性血型为稀有的类孟买血型：Bh分泌型，Lewis表型为 Le(a-b+)。

表1 ABO血型检测结果

表2 H和Lewis血型检测结果

2.2 ABO血型基因检测结果 根据电泳胶图中特异性条带和试剂盒的格局表综合分析这名健康男性的基因型为ABO* O01/B101，电泳胶图见图1。

2.3 FUT1基因直接测序结果 将直接测序结果与FUT1数据库进行比对发现在nt661处FUT1基因存在有1处错义突变即C->T(见图2)，导致221位的氨基酸由精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys)， H酶活性减弱甚至是失活，通过与dbRBC BGMT数据库的比对，这种突变导致的类孟买血型是第36个类孟买血型(见图3)。

注：1：O01；2、non O01；3、O03；4、non O03；5、B101；6、non B101；7、A201；8、non A201 阳性条带：1,2,4,5,6,8，根据试剂盒格局表ABO血型基因分型结果为ABO*001/B101

图1 ABO 血型基因分型结果

3 讨论

H缺乏表现型(H-deficient)又被称为类孟买血型是指红细胞完全或部分缺乏H抗原而在唾液等分泌液中有ABH物质的一种稀有表现型，引起H抗原缺乏的原因主要为控制红细胞H抗原合成的FUT1基因突变导致H抗原合成障碍，从而导致AB 血型抗原合成异常，引起ABO 血型鉴定错误和输血困难，因此在输血实践中具有重要的临床意义[5,6]。

FUT1基因位于19q13.3，全长7 380 bp，有4个外显子，具有编码蛋白能力的序列位于第4外显子，由1098个碱基组成，编码365个氨基酸，FUT1基因编码α-1,2-岩藻糖糖基转移酶，将底物GDP-L-半乳糖上的岩藻糖基转移到前体糖链分子末端半乳糖基的C-2位形成H抗原，H抗原表达在红细胞系、表皮的上皮细胞以及血管内皮细胞，无活性的FUT1基因在纯合子状态不能表达H抗原[7]。类孟买血型具有明显的遗传异质性和区域性，根据dbRBC BGMT公布的数据和目前国内文献分析来看，目前在不同人种(群)中共发现60种FUT1基因，FUT1基因异常包括缺失、错义突变和插入突变等，且大部分都是错义突变。中国人群发现10余种FUT1基因型，其中最常见的FUT1基因型是h1：FUT1 547-552delAG；h2：FUT1880-882delTY；h3：FUT1658T等[8-10]，本次报道的FUT1基因突变是错义突变，这个突变型是第36个FUT1突变型，表现为红细胞上H抗原弱表达的类孟买血型，是非常稀有的型别，在澳大利亚人中发现，这一种突变型中国人群中为首次报道。在nt661C->T，导致221位的氨基酸由精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys)，精氨酸(Arg)为碱性氨基酸，等电点(pI)值为l0．76，而半胱氨酸(Cys)为中性氨基酸，pI值为5.05，这2个氨基酸在物理化学性质方面差异很大，推测这个氨基酸的取代可能降低α-1,2-岩藻糖转移酶的生物活性，使红细胞上的H抗原减弱，推测由于该名男子带有正常的B基因，能产生正常的B酶(α-1,3-D-半乳糖基转移酶)，会将红细胞上弱H抗原为底物，全部转化为B抗原，因此红细胞上有较多的B抗原，而H抗原缺乏。

备注：测序结果显示FUT1在nt661处存在有1处错义突变即C->T

图3 dbRBC BGMT数据库中第36个FUT1基因

目前类孟买血型的确认主要是依靠血清学实验，它的血清学基本特点为：红细胞表面有弱的A、B抗原，与高效价抗-A或抗-B长时间反应可出现弱凝集，或可通过吸收放散实验检出，与抗-H不发生反应，但与孟买型的抗-H有弱凝集，血清中有抗-HI冷抗体，唾液中可检出少量的ABH血型物质[11]。实验室进行血清学检测时发现不同厂家的ABO血型试剂在检测时有差异，多次离心和4℃放置的检测能力有差异，但在4℃放置5分钟后均能检测出较强的B抗原，血清中检出抗A1和抗A抗体未检出抗-HI抗体，提示在实际工作中为防止漏检，可选择两种以上不同厂家的血型试剂，并为了防止类孟买血型的漏检应在疑难血型检测策略中增加抗-H血型试剂的使用。

血型的正确定型在临床输血中具有重要的临床意义，在临床实践中为避免亚型、孟买型和类孟买型的漏检，为患者提供安全、可靠的血液，对于血型有疑问的血液标本，建立合适的血型筛查策略具有重要的意义。

致谢： 感谢浙江省血液中心输血研究所许先国老师的指导和大力支持！

[1]胡丽华，主编.临床输血学检验[M].第3版.北京：人民卫生出版社.2013：21-22.

[2]丹尼尔主编，朱自严主译.人类血型[M].原书第2版，北京：科学出版社，2007：9-19.

[3]和艳敏，许先国，朱发明等.2例类孟买表型的分子机理研究[J].中国实验血液学杂志,2007,15(3)：626.

[4]Lixing Yan,Faming Zhu,Xianguo Xu,et al.Molecular basis for para-Bombay phenotypes in Chinese persons,including a novel nonfunctional FUT1 allele[J].Transfusion,2005,45:725.

[5]张进萍，郑 妍，孙冬妮.FUT1基因杂合或纯合突变致类孟买血型形成研究[J].中国实验血液学杂志,2014,22(1)：195.

[6]梁延连，苏宇清，喻 琼,等.类孟买型在两个近亲与随机婚配家系中的遗传特点[J].现代检验医学杂志,2009,24(3)：48.

[7]梁 伟，陈秀丽，杨 亮,等.类孟买血型家系α-1,2-岩藻糖转移酶基因突变的分析[J].中华检验医学杂志,2015,38(7)：487.

[8]骆 宏，林健伟，林树德,等.类孟买血型两例的分子遗传学机制研究[J].中国检验医学杂志,2012,35(9)：815.

[9]黄丹丹.2例类孟买血型的分子机制研究及家系调查[J].中国输血杂志,2013,26(9)：850.

[10]许德义，邓 刚，黄丹丹,等.两例类孟买血型的FUT1基因突变分析[J].中国医学遗传学杂志,2011,28(5)：694.

[11]张印则，徐 华，周华友主编.红细胞血型原理与检测策略[M].北京：人民卫生出版社,2014：49-50.

Study on the molecular mechanism of Bhpara- Bombay phenotype

WANGFang,MAOWei,ZHANGTao,etal.

(ChongqingBloodCenter,Chongqing400015,China)

Objective to study serological characteristics of blood type and molecular mechanism of Bhpara-Bombay phenotype.Methods ABO and H antigens were detected with routine serological technique,SSP method and the direct sequencing method were used respectively to the confirm of ABO blood group genotypes and FUT1 gene sequence analysis.Results Serological results confirmed as Bhsecretory type，the result of ABO gene was O01/B101,Direct sequencing indicated that FUT1 sequnce contained a missence mutation(C->T) at nt661,which could cause the change of amino acid at position 221Arg→Cys.Conclusion The mutantion of FUT1 gene at nt 661 was the 36th mutant,showed the RBC weak H antigen expression type of para-Bombay phenotype,this kind of mutant China reported for the first time in the crowd.

para-Bombay;Molecular mechanism;FUT1gene

1007-4287(2017)07-1249-04

R457.1+1

A

2016-10-21)