生酮饮食导致小鼠骨质疏松的显微骨结构和生物力学研究

吴秀华 王晓萌 黄志平 刘俊豪 黄祖成 孔刚刚 朱青安

南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东 广州 510515

生酮饮食(ketogenic diet，KD)是一种高脂肪、低碳水化合物的配方饮食，使机体产生酮体代谢，提高血液中β羟丁酸水平。生酮饮食时酮体成为主要的能量来源[1]，相对于糖代谢而言，酮体进入三羧酸循环代谢产生能量速度较快[2]，消耗同等量氧气时，酮体产生的能量更多。1921年Wilder提出KD治疗儿童癫痫[3-4]，目前在临床上是儿童耐药性癫痫的治疗手段之一，也用于治疗急性和退变性神经系统疾病。虽然国内外文献报道KD总体上是安全和有效[5]，但其不良反应和对生长发育的影响也受到关注[6]。例如，有多个KD治疗耐药性癫痫不良反应的报道，出现肾结石、缺铁性贫血、继发性肉碱缺乏、心肌病、骨密度降低等[7]。尽管观察到生酮饮食用于治疗儿童耐用性癫痫时会引起骨质疏松，但还缺少相应的实验研究。本文采用生酮饮食喂养成年C57雌性小鼠3个月，分析股骨远端松质骨和中段皮质骨的显微结构，以及测量胫骨三点弯曲的力学性能，评价生酮饮食导致的骨质疏松，为临床上观察生酮饮食对骨代谢的影响提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型与分组

10只8周龄雌性C57小鼠由南方医科大学动物中心提供，体重16～18 g，随机分为生酮饮食和正常饮食(SD)组，每组5只，喂养3个月。KD组给予“奇酮奶”喂养，SD组每天给予普通饲料喂养。每两周通过剪尾法取血，测定血糖、血酮、体重。

SD组由南方医科大学动物实验中心提供的普通饲料喂养。KD组喂养由深圳捷利康公司生产的“奇酮奶”，其碳水化合物与脂肪的比例为1:4。“奇酮奶”已用于临床上治疗儿童耐药性癫痫，其基本营养素含量详见表1。喂养3个月后的小鼠在过量麻醉下处死。取小鼠双侧股骨和胫骨，股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，而胫骨新鲜地冷冻于-80 ℃冰箱中。

表1 普通饲料与生酮饮食成分Table 1 Components of normal and KD diets

1.2 骨微结构分析

对所有小鼠的右侧股骨行显微CT分析。右侧股骨垂直放入显微CT标本杯中，并用圆形泡沫柱稳妥固定，行显微CT(μ80，Scanco公司，瑞士)扫描。预扫完毕后分别选择股骨远端1/3的部位和股骨中段180层作为感兴趣区域，进行批量扫描。扫描参数设置为电压55 kv，电流145 μA，层厚为12 μm。扫描完成后，从图层中没有股骨髁的层数开始选取100层，采用显微CT自带软件进行松质骨显微结构分析，测量骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目 (Tb.N)、骨小梁间隙(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、各向异性程度(DA)、结构模型指数(SMI)、骨小梁连接密度(Conn.D.)等。测量股骨中段的100层皮质骨的厚度(Ct.Th)、骨体积分数(BV/TV)、皮质骨骨密度(BMDBV)、皮质骨横截面面积(Barea)。

1.3 胫骨三点弯曲测试

右侧胫骨标本在室温下解3 h后，采用电磁伺服材料试验机(E1000，Instron公司，美国)对其进行三点弯曲实验。具体方法如下：采用游标卡尺测量胫骨长度，以确定胫骨的中点；将胫骨放置于自制的三点弯曲支架上，支架的跨距为10 mm，两端支架到胫骨中点的距离为5 mm，以1 mm/min的速度在胫骨中点向下横向压缩至破坏。连续记录载荷和位移，从载荷-位移曲线中得到最大载荷、刚度、最大吸收能量。

1.4 股骨组织学

取左侧股骨清水冲洗后用EDTA脱钙4 w，针刺无阻力感后开始脱水，浸蜡，石蜡包埋。行纵向切片，厚度为4 μm。行HE染色，观察股骨远端骨小梁分布。

2 结果

2.1 小鼠的体重、血糖、血酮情况

KD组小鼠在2 w、4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的体重分别为(18.3±1.3)g、(18.3±1.2)g、(21.3±1.2)g、(20.0±1.4)g、(21.3±1.2)g和(22.3±1.2)g，而SD组在各时间点的体重分别为(19.5±1.3)g、(19.8±0.5)g、(20.5±0.5)g、(22.5±0.5)g、(23.5±1.5)g和(23.5±0.5)g，两组间体重在各个时间点的差异均无统计学意义。KD组在4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的血糖水平分别为(13.6±2.1)mmol/L、(9.7±1.5)mmol/L、(14.5±1.9)mmol/L、(14.5±2.2)mmol/L和(11.5±1.8)mmol/L，SD组在各时间点分别为(8.6±1.2)mmol/L、(9.5±0.9)mmol/L、(12.1±1.6)mmol/L、(12.3±1.8)mmol/L和(12.5±2.1)mmol/L，两组间血糖水平在各个时间点的差异均无统计学意义。KD组在2 w、4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的酮体水平分别为(1.2±0.3)mmol/L、(0.9±0.2)mmol/L、(1.0±0.3)mmol/L、(0.8±0.1)mmol/L、 (0.9±0.2)mmol/L和(0.9±0.2)mmol/L，而SD组各时间点分别为(0.1±0.1)mmol/L、(0.1±0.1)mmol/L、(0.1±0.1) mmol/L、(0.5±0.2)mmol/L、(0.2±0.1)mmol/L和(0.2±0.1)mmol/L，两组间血酮水平在各个时间点的差异均有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1 生酮饮食和正常饮食小鼠的体重、血糖、血酮水平Fig.1 Weight, blood glucose and blood ketone of mice in the SD and KD groups

2.2 股骨微结构

KD组股骨远端松质骨的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、连接密度均低于SD组，且骨小梁间隙变大，两组间骨密度、骨体积分数、连接密度等的差异有统计学意义(P<0.05)(表2和图2、3)。

两组间股骨中段皮质骨骨密度、骨体积分数或皮质骨厚度的差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)，而KD组皮质骨平均横截面积显著小于SD组(P<0.05)(图2)。

表2 生酮饮食和正常饮食小鼠股骨远端松质骨和中段皮质骨的结构参数Table 2 Structural parameters of cancellous bone at distal femur and cortical bone at middle femur in mice under the two diets

注：表内数值为平均值±标准差。每组小鼠数量为5只。*表示与SD组比较的差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 生酮饮食和正常饮食小鼠股骨远端显微CT重建和横断面图像Fig.2 Micro-CT images of cancellous bone at distal femur in the two diet groups

图3 生酮饮食和正常饮食小鼠股骨中段皮质骨显微CT图Fig.3 Micro-CT images of cortical bone at middle femur in the KD and SD diet groups

2.3 胫骨三点弯曲

与SD组相比较，KD组胫骨三点弯曲的最大力、最大桡度、刚度、最大吸收能量均有下降趋势(表3)。两组间最大力、刚度和最大吸收能量的差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 小鼠胫骨三点弯曲实验的力学参数Table 3 Mechanical parameters of the three-point bending test of tibia in mice

注：表内数值为平均值±标准差。每组小鼠数量为5只。*P<0.05。

2.4 股骨组织学

HE染色的组织学图片也表明KD组股骨远端骨小梁稀疏、数量减少，骨小梁间隙增大(图4)。

图4 生酮饮食和正常饮食小鼠股骨远端HE染色的组织学图像Fig.4 Histological images of distal femur by HE staining in KD and SD diet groups

3 讨论

已证实生酮饮食在多种神经系统疾病中有神经保护作用，对于儿童耐药性癫痫有治疗作用，本文进一步研究其对骨代谢的影响。本研究发现生酮饮食弱化了小鼠股骨远端松质骨的微结构，导致松质骨骨质疏松。本研究还发现生酮饮食尽管对皮质骨的微结构没有影响，但减少了其几何尺寸，导致皮质骨骨质疏松。从生物力学和组织学上证实了生酮饮食导致的骨结构的弱化和生物力学强度的降低。

生酮饮食是一种特殊的高脂饮食，其极低的碳水化合物含量使得机体从糖代谢转为酮体代谢[8]。酮体代谢很容易受到破坏，少许的碳水化合物就可以使体内的酮体水平大幅度降低，且需要较长时间才能恢复。所以，生酮饮食有别于一般的高脂饮食，它导致了机体代谢的转变，维持血糖水平正常，但高血酮水平[9]。多个研究证实高脂饮食弱化C57小鼠股骨松质骨骨结构[10-12]，导致的骨质疏松与去势骨质疏松相似，但股骨中段皮质骨未发生明显变化[13]。本文发现生酮饮食不仅弱化小鼠松质骨骨结构，而且减少了皮质骨横截面积，弱化了生物力学性能。这可能是在酮体代谢下特有的现象，值得进一步的研究。因此，生酮饮食导致的骨质疏松可能不同于高脂饮食所导致的骨质疏松，这也为皮质骨的骨质疏松造模提供了一种方法。

本文在研究中观察到生酮饮食6w的小鼠股骨松质骨和皮质骨均未发生明显变化，说明短期的生酮饮食对骨代谢的影响不大。这提示在临床上使用生酮饮食作为治疗癫痫的手段时，要注意其对骨代谢所产生的不利影响。

有报道发现更高酮体水平对急性脊髓损伤的神经保护作用更为明显[14]。本文采用的生酮饲料是临床上用于治疗儿童耐药性癫痫的食品之一，其蛋白质和碳水化合物与脂肪比例为1∶4，可使小鼠的血酮水平达到1.0 mmol/L。今后还需要研究更高比例的生酮饮食对骨代谢的影响，确定骨代谢对酮体水平的依赖性。

总之，本文证实了生酮饮食对小鼠骨代谢的影响，不仅导致松质骨的骨质疏松，还导致皮质骨的弱化，提示需要进一步探讨生酮饮食引起骨质疏松的机理，观察生酮饮食对成骨细胞和破骨细胞的抑制或增殖作用，研究其作用的分子机制。