耐硒产纤维素酶菌株的筛选

袁 帅 王宇哲 张可然 黄凤华 张西锋

(武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

耐硒产纤维素酶菌株的筛选

袁 帅 王宇哲 张可然 黄凤华 张西锋

(武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

采用硒选择培养基和刚果红平板法对耐硒产纤维素酶菌株进行初筛，通过透明圈的大小筛选了耐2500mg/L浓度Se的13株菌株，并对筛选菌株的产纤维素酶活力进行了初步的检测。

纤维素酶 菌株

1 前言

纤维素是植物光合作用下产物，且是目前自然界中含量非常大的一类可再生资源，有机肥料等部分物质可由其制备而成，但每年也会有大量秸秆等富含纤维素的生物体被焚烧造成环境的污染和资源的浪费，因此，如何利用好自然界中的纤维素对人类未来的发展有着重要的意义。目前，肥料是农作物的生长所离不开的物质，而有机肥料则需要通过秸秆等物质内部纤维素的分解来进一步生产，同时人们对健康生活的追求使富硒产品的需求量增加。但目前大部分土壤并不是富硒的环境，所以非富硒地区的农业生产开始对富硒有机肥料有所需求，通过在农作物的生长过程中加入有机肥料的方式来达到农作物含硒的目的。而富硒有机化肥的生产离不开可耐受高浓度硒的纤维素菌种或菌群，所以，筛选出耐受高浓度硒的纤维素菌种或菌群对富硒有机化肥的生产有着重要的意义。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 土样：湖北恩施富硒矿床土样。

2.1.2 其他实验材料：蛋白胨、酵母提取物、蒸馏水、氯化钠、氯化钾、硝酸钾、氢氧化钠、磷酸二氢钾、亚硒酸钠等均为国产试剂。

2.2 培养基

2.2.1 富集培养基和液体发酵培养基：

富集培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，自然pH值。液体发酵培养基：富集培养基+Na2SeO3 150mg/L。

2.2.2 梯度硒选择培养基和富硒固体培养基：

梯度硒选择培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 1g/L，Na2SeO3（500、1000、1500、2000和2500）mg/L，自然pH值。富硒固体培养基：梯度硒选择培养基+琼脂粉15g/L。

2.2.3 刚果红筛选纤维素琼脂培养基：

KNO3（2g/L），KH2PO4（1g/L），MgSO4（0.5 g/L），NaCl（1g/L），Na2HPO4（1g/L），CMC-Na（20g/L），Na2SeO32500mg/L，琼脂（15g/L），自然pH值。

2.2 方法

2.2.1 耐硒菌种的分离：

收集湖北恩施富硒茶田土富硒土样，将土样放入烧杯中，加入无菌磷酸盐缓冲液悬浮，在常温、180r/min的环境下于摇床中振荡30min，静置，待沙砾和大颗粒沉降后收集悬浮液。取悬浮液的一部分经5000r/min离心10min后，收集沉淀（沉淀用5ml无菌磷酸盐缓冲液悬浮后放入4℃冰箱保存）。另一部分2ml的悬浮液加入富集培养基中扩培，在37℃、180r/min的条件下振荡培养2d，放入4℃冰箱保存。

取上述扩培液加入含150μg/ml Na2SeO3的液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在37℃、180r/min的条件下振荡培养2天。以5%接种量继代培养4次后，接种到硒的浓度为Se（500、1000、1500、2000和2500mg/L）的梯度硒选择培养基中，继续培养48h。在2500mg/L的梯度硒选择培养基中存活的菌株即为耐硒的菌株。

2.2.2 耐硒纤维素分解菌的分离：

取耐硒菌液，经蒸馏水稀释后涂布在相对应浓度Na2SeO3（2500mg/L）的刚果红筛选纤维素琼脂培养基上，在37℃恒温培养箱中培养48h，在培养结束后往培养皿中加入适量的刚果红溶液，染色1h后弃去染液，加入适量1 mol/L的NaCl溶液，洗涤1h。根据菌落周围透明圈直径与菌落直径的比值大小选择菌株。对比值大的菌落进一步分离并保存，在编号后用于后续纤维素酶活力强弱的研究测定。共筛选出了13株耐硒菌株。

2.2.3 标准曲线的绘制

标准曲线的绘制采用文献1的方法[1]。

2.2.4 内切型β-葡聚糖酶活力的测定

内切型β-葡聚糖酶活力的测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[2]。

3 结果

3.1 标准曲线的绘制

以吸光度为纵坐标，葡萄糖溶液含糖的毫摩尔数（酶活力）为横坐标，绘制标准曲线的标准曲线如下：y=0.1597x-0.0807。

图1 标准曲线

3.2 菌种的分离与筛选

通过刚果红染色使产纤维素酶的菌落周围形成透明圈，如下图所示。共筛选出13株耐硒2500mg/L的菌株。使用刚果红平板筛选法可以更好地筛选出耐硒纤维素菌，可以非常直观地看出平板上分布着各种大大小小的透明圈，一个透明圈就意味着存在这样一个耐硒菌种。另外根据菌种周围透明圈的大小可以判断出它的酶产量，透明圈越大说明它的酶产量越多，透明圈成型越快说明它的产酶量越快。

图1 菌株在平板上形成的透明圈（箭头所指）

3.3 菌株纤维素酶活力的测定

以液体LB培养基培养菌株筛选的耐硒菌株，在12h和24h分别取样，测定内切型β-葡聚糖酶的活力。

Table 1 12h内切型β-葡聚糖酶的活力

Table. 2 24h内切型β-葡聚糖酶的活力

4 结论

纤维素是地球上最廉价和最丰富的可再生资源，可以转化为饲料、能源、化工原料和食品等。但纤维素酶活力不高制约了纤维素的广泛应用。因此，选育产酶活力高、遗传稳定性好的菌株是解决纤维素有效利用的关键问题之一。硒是人体必需的微量元素。硒在提高人体免疫力和抗氧化方面具有非常好的功效，并具有抗肿瘤活性，对多种癌症具有明显的抑制作用。这就促进了富硒食品的研究与开发。富硒有机肥的生产与应用可以解决食品中有机硒的含量。本研究筛选了13株耐硒产纤维素酶菌株，下一步将对各菌株进行鉴定。筛选的菌株可用于富硒有机肥的生产与利用，促进富硒有机肥事业的发展。

[1] 蔡勇.碱性纤维素酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达[D].西北农林科技大学，2005.

[2] 管斌，谢来苏，丁友防，等.纤维素酶酶活力测 定方法的校正[J].无锡轻工大学学报，1999，（4）：20-26.

武汉轻工大学大学生科研项目（xsky2016008）

袁帅（1996-），男，本科生。

张西锋（1977-），男，博士，副教授。