利巴韦林原位聚合分子印迹电化学传感器的研制

华彦涛,徐振林,王 弘,杨金易,孙远明,沈玉栋

(华南农业大学 食品学院/广东省食品质量安全重点实验室,广东 广州 510642)



利巴韦林原位聚合分子印迹电化学传感器的研制

华彦涛,徐振林,王 弘,杨金易,孙远明,沈玉栋*

(华南农业大学 食品学院/广东省食品质量安全重点实验室,广东 广州 510642)

利用原位聚合分子印迹技术,以3-氨基苯硼酸(3-ABBA)为功能单体,利巴韦林(RIB)为目标分子,以硼酸和顺式二醇在不同酸碱度条件下可逆形成环内酯键为原理,在玻碳电极表面原位聚合形成利巴韦林分子印迹膜,研制了测定利巴韦林的分子印迹电化学传感器。采用循环伏安法(CV)和差分脉冲法(DPV)对印迹膜性能进行研究。 DPV测试表明：在最优实验条件下,利巴韦林的浓度在5.0×10-8～1.0×10-5mol/L范围内与峰电流呈良好的线性关系,相关系数(r2)为0.995 3,检出限(S/N=3)为1.5×10-8mol/L。特异性实验表明制备的传感器对利巴韦林的选择性良好。该分子印迹电化学传感器可用于食品中利巴韦林的检测。

利巴韦林(RIB)；原位聚合；分子印迹聚合物(MIP)；电化学传感器

利巴韦林(RIB)是人工合成的核苷类广谱抗病毒药,对许多DNA和RNA病毒有抑制作用,可用于病毒性感冒、肺炎等病症的治疗[1-4]。随着我国畜禽饲养集约化水平的提高,传染病的发生与流行已成为阻碍我国畜禽业快速发展的重要因素,因病毒感染导致动物死亡的比率仅次于细菌感染的致死率,占36.8%,且发病率呈上升趋势。因此,继抗生素药物后,抗病毒药物被大量用于畜禽产品生产中,如利巴韦林等抗病毒药物常被用于鸡、猪流感的预防和早期治疗及猪传染性胃肠炎的防治等。而长期大量使用这些药物会导致动物中毒、免疫抑制、药物残留等问题,同时还可使病毒产生变异[5-8]。农业部第426号与560号公告和《兽药管理条例》规定,禁止利巴韦林、金刚烷胺等人用抗病毒药物作兽药。美国FDA 也于2006 年禁止利巴韦林类抗流感病毒药物用于禽类。目前抗病毒类药物已列为我国畜禽产品普查及风险监测的重点对象,因此,建立其快速有效的检测方法对于食品安全监控极为重要。

利巴韦林的检测主要包括液相色谱(LC)[8-9]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[10-15]等方法。该类大型仪器检测准确、灵敏度高,但存在设备昂贵、需专业人员、前处理复杂耗时等不足。目前分子印迹传感器已被广泛用于农兽药小分子药物残留的检测,并且新型纳米材料的应用使得电化学传感器的检测灵敏度更高。而且分子印迹电化学传感器制备简单,检测药物耗时短、费用低,且电极能重复利用,样品前处理简单[16-18],可与高效液相色谱-质谱确证技术结合应对量大面宽的农产品、食品安全快速筛查需求。分子印迹电化学传感器敏感膜的制备方法包括分子自组装法、溶胶-凝胶法、表面涂覆法、原位聚合、光或热聚合等。其中原位电聚合电化学聚合是在印迹分子存在的情况下,功能单体分子发生电化学聚合,构成一种包含有印迹分子的聚合膜。相比于其他方法,电化学聚合方法操作简单,在功能单体和印迹分子的溶液中进行电聚合即可实现,还可通过控制流通电荷的量获得重复性优良的超薄膜,并且该方法制得的聚合膜具有很好的刚性,去除印迹分子后印迹空穴不易变形,具有良好的重现性。目前,有关利巴韦林的分子印迹电化学检测技术尚未见报道。本文利用3-氨基苯硼酸为功能单体,利巴韦林为目标分子,以硼酸和顺式二醇在不同酸碱度条件下可逆形成环内酯键为原理,采用原位电聚合方法,在电极表面原位聚合制备分子印迹膜,通过表征,实现了对抗病毒药物利巴韦林的简便、快速检测,对于有效检测利巴韦林具有重要的参考和实用价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学工作站(上海辰华仪器公司)；三电极系统：玻碳电极；分子印迹电极(MIP)或非印迹电极(NIP)为工作电极；饱和Ag/AgCl电极为参比电极；铂柱电极为对电极；利巴韦林(Ribavirin,RIB)、阿卡地新(Acadesine,AC)、3-氨基苯硼酸(3-Aminobenzeneboronic acid，3-ABBA)纯度均为99%,购于上海阿拉丁生化试剂有限公司；其他试剂均为分析纯,购于上海阿拉丁生化试剂有限公司,实验用水为一级水。

图1 以利巴韦林为模板分子的分子印迹聚合物的制备过程Fig.1 Schematic representation of the preparation process of molecularly imprinted polymers(MIPs) using RIB as template

1.2 印迹与非印迹电极的制备

首先将100 μL 0.05 mol/L利巴韦林溶液和1 mL 0.005 mol/L 3-氨基苯硼酸溶液分别加入6 mL磷酸缓冲液(PBS,0.05 mol/L,pH 8.0)中,超声混合均匀。然后将处理好的裸玻碳电极、铂丝电极与饱和甘汞电极浸入上述溶液。通过循环伏安法进行电聚合,调整合适的时间制备聚合物薄层修饰的电极,将该修饰玻碳电极浸入0.5 mol/L H2SO4溶液中,调整合适的洗脱时间,脱去镶嵌在聚合物薄层中的利巴韦林分子。作为对照,非印迹电极(NIP)除了不加模板分子RIB,其余步骤同上。图1为分子印迹膜的形成过程。

1.3 检测方法

采用循环伏安法(CV)和差分脉冲法(DPV)对印迹电极进行表征。测定溶液为1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6] (含0.10 mol/L KCl),实验所用溶液均需通氮气除氧处理。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

分别优化了单体和模板分子的摩尔比、聚合时间、洗脱时间、扫描速率和pH值等因素,观察各条件下电极的峰电流变化ΔI(即浸泡在1.0×10-5mol/L RIB溶液MIP/GCE所测定的DPV峰值减去浸泡之前MIP/GCE测定的DPV峰值之差),选出最佳条件。

2.1.1 模板分子与单体分子摩尔比的优化 模板分子与单体分子的摩尔比影响分子印迹聚合物薄膜中印迹空穴的数量,也决定着该传感器对模板分子的重新结合能力和特异性识别能力。本实验对摩尔比进行优化,利巴韦林的浓度为0.05 mol/L,3-氨基苯硼酸的浓度分别为0.05,0.06,0.07,0.08 mol/L(即3-氨基苯硼酸与利巴韦林的摩尔比分别为1∶1,1.2∶1,1.4∶1,1.6∶1),各取100 μL加入6 mL pH 8.0的PBS溶液中制成聚合溶液,制备MIP/GCE。实验结果表明,3-氨基苯硼酸与利巴韦林的摩尔比为1.2∶1时,电流变化值最高。

2.1.2 聚合时间的优化 聚合时间影响聚合薄膜的厚度以及电极的敏感性。在扫描速率为50 mV/s条件下,考察了聚合时间分别为5,10,15,20 min时电极的峰电流变化ΔI。实验表明,聚合时间小于10 min时,制备的聚合薄膜不够稳定；大于10 min则导致聚合薄膜太厚,阻碍溶液和电极之间的电子传递。因此选择聚合时间为10 min,此时的电流峰位变化最明显。

2.1.3 洗脱时间的优化 洗脱时间会间接影响聚合薄膜的厚度和印迹孔穴的数量。随着洗脱时间的增加,洗脱下的RIB模板分子越来越多,生成的印迹孔穴也增多,电流变化值增大。本实验设定的洗脱圈数分别为5,10,15,20圈,实验表明洗脱圈数越多,电流峰位变化越明显,增加到一定圈数之后,RIB分子基本洗脱干净,15圈之后,电流峰位基本不再变化,所以实验选择洗脱圈数为15圈。

图2 MIP/GCE和NIP/GCE的循环伏安曲线图Fig.2 Cyclic voltammograms of different modified electrodes a.MIP/GCE before elution,b.MIP/GCE after elution, c.NIP/GCE after elution;d.NIP/GCE before elution； 5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6],0.1 mol·L-1 KCl

2.1.4 扫描速率的优化 扫描速率与聚合薄膜的紧密程度有关,并影响传感器的敏感程度。当扫描速率较低时,制得的聚合膜较为紧密,反之扫描速率过大时,制得的聚合薄膜较为疏松粗糙,导致传感器的选择识别能力下降。本实验设定扫描速率分别为25,50,75,100 mV/s。实验结果表明,随着扫描速率的增加,电流变化值先增大后减小,在50 mV/s时达最大,故选择最优的扫描速率为50 mV/s。

图3 不同浓度RIB在传感器的DPV响应Fig.3 DPV responses of RIB with different concentrations on MIP sensor concentration of RIB(from a to g):0,1.0×10-8，5.0×10-8， 5.0×10-7，5.0×10-6,1.0×10-5，5.0×10-5 mol/L; K3[Fe(CN)6],0.1 mol·L-1 KCl

2.1.5 支持电解质pH值的优化 分别配制pH值为6.0,7.0,8.0,9.0的电解液,考察了电解质pH值对传感器峰电流的影响。结果表明,pH值偏低时,会减少苯硼酸与邻二醇形成环内酯的可能性,pH值偏高时会破坏印迹膜的稳定性,导致模板分子的识别能力下降。由于pH 8.0时,峰形较为合理,且响应电流最好,故选用底液的pH值为8.0。

2.2 分子印迹膜的电化学表征

2.2.1 不同电极的循环伏安图 选择1 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液作为电化学活性探针测试不同电极的电化学行为。图2为MIP/GCE和NIP/GCE的循环伏安曲线。由图可知，MIP/GCE在洗脱前，没有出现明显的氧化还原峰(图2b)，而在洗脱RIB分子后，出现了明显的氧化还原峰(图2a)。然而NIP/GCE在洗脱前(图2d)与洗脱后(图2c)均未出现较明显的氧化还原峰。表明MIP/GCE经洗脱后出现印迹孔穴，而NIP/GCE则未得到。

2.2.2 传感器的响应特征 在最优条件下,采用差分脉冲法(DPV)研究电极的氧化峰电流与利巴韦林浓度的关系,实验结果如图3。在5.0×10-8～1.0 ×10-5mol/L浓度范围内,DPV测定的氧化峰电流与利巴韦林浓度呈良好的线性关系,其线性回归方程为I(μA)=0.819 9c(μmol/L)+ 4.524,线性相关系数(r2)为0.995 3,检出限(S/N=3)为1.5×10-8mol/L。该传感器显示了高灵敏度,且制作简便、价格低廉。

2.2.3 传感器的选择性 选择RIB的结构类似物阿卡地新(Acadesine,AC)、单体类似物苯甲酸钠(Benzoic acid,BEN)考察MIP/GCE的选择性。考察了1.0×10-5mol/L的RIB和AC在MIP/GCE和NIP/GCE上的电流变化,结果发现，RIB在MIP/GCE上的响应电流值ΔI较大,在NIP/GCE上的响应电流非常小,而AC在MIP/GCE与NIP/GCE上的响应电流均非常小,说明MIP/GCE对RIB具有很好的识别能力,对AC的特异性识别能力较弱。主要是因为本方法以3-氨基苯硼酸与顺式邻二醇可逆形成环内酯键为原理,虽然AC与利巴韦林结构相似,但因为AC有另外的氨基存在,会造成空间位阻,干扰邻二醇与苯硼酸的聚合,因此MIP/GCE对AC选择性较弱。

实验同时考察了MIP/GCE的抗干扰能力,对1.0×10-5mol/L RIB+1.0×10-3mol/L AC溶液和1.0×10-5mol/L RIB +1.0×10-3mol/L苯甲酸钠(BEN)溶液进行测定。检测结果显示,100倍于RIB的AC和BEN的存在均对RIB的测定无明显影响。MIP/GCE显示了良好的抗干扰能力。

3 结 论

本文分别以3-氨基苯硼酸与利巴韦林为功能单体与目标分子,在玻碳电极表面原位电聚合形成利巴韦林分子印迹膜,制备了分子印迹电化学传感器。该传感器具有快速结合模板分子的能力,对利巴韦林具有良好的选择性。通过循环伏安法(CV)和差分脉冲法(DPV)对印迹膜性能进行了研究。利巴韦林的浓度在5.0×10-8～1.0×10-5mol/L范围内与峰电流呈良好的线性关系,相关系数为0.995 3,检出限为1.5×10-8mol/L。与利巴韦林的其他检测方法(如LC,LC-MS等)相比,该传感器制备方法简单,检测时间短,检出限较低,稳定性好,有望用于食品中利巴韦林残留的检测。

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Development of an Electrochemical Sensor for Detection of Ribavirin Based on In-situ Polymerization Molecularly Imprinted Film

HUA Yan-tao，XU Zhen-lin,WANG Hong,YANG Jin-yi,SUN Yuan-ming，SHEN Yu-dong*

(Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

A novel electrochemical sensor for the determination of ribavirin(RIB) was fabricated by molecularly imprinted technology，based on 3-aminobenzeneboronic acid as functional monomer，and ribavirin as target molecule.A molecularly imprinted polymers(MIPs) membrane was synthesized on the surface of glassy carbon electrode in vacuum drying oven，by the formation principle of ring ester bond with boric acid and vicinal diol.The electrochemical behavior of the membrane was characterized by cyclic voltammetry(CV) and differential pulse voltammetry(DPV).Under the optimum conditions，the response of peak currents was linear to concentration of RIB in the range of 5.0×10-8-1.0×10-5mol/L with a detection limit(S/N=3) of 1.5×10-8mol/L.The electrochemical sensor has the advantages of high sensitivity，good stability and high reproducibility，and could be uesd to detect RIB in food.

ribavirin(RIB)；in-situ polymerization；molecular imprinting polymer (MIP)；electrochemical sensor

2017-03-07；

2017-03-25

国家自然科学基金项目(31371769)；广东省科技计划项目(2014A020219008，2014A050503059，2014A030311043)；广州市科技计划项目 (201704020082)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.015

O657.1；TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0921-04

*通讯作者：沈玉栋,博士,教授,研究方向：食品质量与安全研究,Tel：020-85283448，E-mail：shenyudong@scau.edu.cn