肇东盐单胞菌中胞苷酸激酶基因cmk的克隆与功能分析

姜巨全，杨立娜，刘艳双，孙开福

肇东盐单胞菌中胞苷酸激酶基因cmk的克隆与功能分析

姜巨全，杨立娜，刘艳双，孙开福

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）

为探究一株中度嗜盐菌-肇东盐单胞菌（Halomonas zhaodongensis）NEAU-ST10-25T的耐盐碱机制，采用基因文库筛选方法从该菌株获得一个重组质粒pUC-LYS 1。该质粒可恢复大肠杆菌（Escherichia coli）Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc在含有0.2 mol·L-1NaCl的LBK培养基上生长。序列分析显示，重组质粒pUC-LYS1中外源DNA片段由1个N端截短的ORF1、三个完整的ORF（ORF2-4）以及1个C端截短的ORF5组成。其中，ORF4与伸长盐单胞菌（Halomonas enlongata）中1个推测的胞苷酸激酶（Cytidylate kinase,CM K）同源性最高（86%）。为便于区分与其同源物，编码ORF4的基因cmk来自肇东盐单胞菌（Halomonas zhaodongensis）被定名为Hz_cmk。Hz_CMK也与包括已被鉴定来自大肠杆菌（E.coli）的Ec_CMK等其他同源物具有较高同源性。为进一步鉴定Hz_cmk是否编码胞苷酸激酶，通过PCR扩增分别将Hz_cmk和大肠杆菌（E.coli）的同源基因Ec_cmk（作为正对照）构建至原核表达载体pET19，转化到大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）感受态细胞中诱导表达。SDS-PAGE表明其以可溶形式存在。酶学分析表明Hz_CMK与Ec_CMK均具有较高胞苷酸激酶活性。为国内外首次中度嗜盐菌的胞苷酸激酶基因功能鉴定。

肇东盐单胞菌；胞苷酸激酶（CMK）；原核表达；酶活性

核苷酸作为生物大分子，是构成核酸重要原料，并作为能源物质在生化反应中起重要作用[1]。生物体合成核苷酸分为两个途径：一是从头合成途径，即细胞利用小分子物质，经多个酶促反应，最终合成核苷酸。二是补救合成途径，即利用细胞中游离碱基和核苷，经简单反应生成核苷酸[2]。一些组织、细胞在缺乏从头合成途径所需原料时，仅能通过补救途径合成核苷酸[3]。例如，嘧啶核苷酸可通过补救途径产生，并产生共同产物UMP[4]。随后，UMP磷酸化成UDP和UTP，进一步完成CMP等其他嘧啶核苷酸合成[5]。在补救途径合成嘧啶核苷酸过程中，核苷一磷酸激酶（NMK）可逆性催化三磷酸核苷的磷酰基转移（通常ATP）至特定NMP上，是核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸代谢中关键酶[6]。在细菌中，胞苷酸激酶（CMK）是嘧啶核苷酸代谢关键酶，负责催化磷酸基团转移，即催化CMP（dCMP）转化为CDP（dC DP），ATP提供磷酸基团，成为ADP[7]。CMK作为NMK家族一员，可减少CMP积累，通过产生CDP磷酸化生成CTP。CTP和dCTP是生物大分子RNA、DNA和磷脂合成前体[8-9]。在探索一株中度嗜盐菌-肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T[10]耐盐碱机制过程中，采用基因文库与大肠杆菌（E.coli）Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc[11]结合技术，克隆一个编码胞苷酸激酶的基因Hz_cmk。研究发现该基因与肇东盐单胞菌耐盐碱机制有关，即可通过胞苷酸激酶（CMK）以补救途径合成CMP，借助CTP和dCTP在磷脂合成中的作用，产生相容性物质，具有耐盐碱功能。本文对中度嗜盐菌的胞苷酸激酶基因作功能鉴定，证实该基因编码胞苷酸激酶，为揭示该基因耐盐碱机制提供新思路并奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌株和质粒

肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T为本实验室分离并鉴定新种，保存于中国微生物菌种保藏中心（编号CGMCC 1.12286T）和德国微生物菌种保藏中心（编号DSM 25869T）；大肠杆菌（E.coli）KNabc由美国西奈山伊坎医学院Terry A. Krulwich教授赠送，为一株Na+/H+逆向转运蛋白基因（ΔnhaA，ΔnhaB，ΔchaA）缺陷株。大肠杆菌（E.coli）DH5α、C41（DE3）、Trans-T1和感受态细胞以及T-A克隆载体pEasy T3试剂盒均购自北京全式金生物公司。克隆载体pUC18由中国农业大学杨苏声教授赠送。原核表达载体pET19-pphistag（氨苄霉素抗性）由美国维克森林大学W. Todd Lowther教授提供，该载体由提供者在Qiagen公司购买原核表达载体pET19基础上，在组氨酸残基后加入一个PreScission Protease蛋白酶的酶切位点改造而成。

1.1.2 仪器

1.5 mL高速离心机（Thermo Scientific公司），5 mL高速离心机（上海安亭科学仪器有限公司），50 mL高速离心机（Beckman公司），超低温冰箱（Thermo Scientific公司），培养箱（上海志成生物公司），水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂），电泳仪（北京六一生物科技有限公司），凝胶成像仪，pH计（METTLER TOLEDO公司），高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂），分光光度计（天津市普瑞斯仪器有限公司），电转仪（Eppendorf公司），PCR仪（Ep⁃pendorf公司）。

1.1.3 药品及试剂

1 kb DNA Ladder、DL2000，DNA MakerⅣ，RNaseA核糖核酸酶，IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），购自天根生物公司。DNA限制性内切酶：Sau3AI、BamHⅠ、EcoRI，HindⅢ、NdeⅠ、Alkaline Phosphatase（CIAP）牛小肠碱性磷酸酶，购自TaKaRa生物公司。琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒，购自Omega公司。ATP，NADH，CMP，乳酸脱氢酶，丙酮酸激酶以及蛋白电泳所需试剂分别购自Roche、Biotopped、Tiangen等公司。

1.1.4 培养基与培养条件

改良的S-G培养基（1 L）：10 g胰蛋白胨；5 g酵母浸出物；5 g酸水解酪蛋白；2 g KCl；3 g柠檬酸三钠；20 g MgSO4·7H2O，30 g NaCl，pH 7.2～7.4。在制备固体培养基时加入1.5%琼脂；肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T在液体培养基中160 r·min-1、28℃振荡培养24 h。

LBK培养基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，KCl 6.48 g，pH 7.0，部分试验中添加NaCl至所需浓度，或用Tris-HCl（pH 7～8.5）调至所需pH；大肠杆菌（E.coli）转化子在含50μg·mL-1LBK平板上37℃培养，LBK液体培养基中160 r·min-1、37℃培养24 h。

1.2方法

1.2.1 肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T中基因的克隆及序列分析

用Sau3AI酶对肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T基因组不完全酶切后，胶回收4～10 kb片段，与被BamHⅠ酶切并去磷酸化的pUC18载体连接，将连接产物电转至大肠杆菌（E.coli）KNabc感受态细胞中，最后在含有0.2 mol·L-1Na⁃Cl的LBK平板上筛选目的基因。

基因测序由北京华大基因股份有限公司完成。在NCBI上作核苷酸和氨基酸序列比对；用DNAman 6.0绘制质粒图谱并作序列酶切位点分析，核苷酸和氨基酸序列分析等；启动子序列预测借助网站http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter. html完成。

1.2.2 热启动PCR扩增基因

根据重组质粒pUC-LYS1中cmk基因序列和大肠杆菌（E.coli）K12基因组基因（负对照）序列，使用Primer Premier 5.0设计引物，由华大基因合成，引物序列见表1，其中：CATATG为NdeⅠ酶切位点；GGATCC为BamHⅠ酶切位点。平末端加A后，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。

1.2.3 T-A克隆载体构建

按照北京全式金生物技术有限公司pEASY-T3克隆试剂盒说明书进行连接转化。蓝白斑法挑取菌落白色的阳性克隆，提取质粒，作PCR及双酶切验证，基因测序由华大基因公司完成。

表1 Hz_cmk与Ec_cmk上下游引物Table 1 Upstream and downstream primers of genes Hz_cmk and Ec_cmk

1.2.4 表达载体构建

提取质粒pET19-pp-histag和T-A克隆重组质粒，分别用NdeⅠ、BamHⅠ作双酶切（100μL双酶切体系：10×Buffer 10μL，质粒50μL，NdeI 2μL，BamHⅠ2μL，ddH2O 36μL）。将双酶切的pET19-pp-histag及目的基因片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后，16℃过夜连接（连接方法按T4DNA连接酶使用说明书操作）。取适量连接体系，转化大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）感受态细胞。操作方法按大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）感受态细胞使用说明书操作。培养后挑取阳性重组子，待PCR及双酶切验证正确后，送华大基因公司测序，最终确定Hz_cmk和Ec_cmk是否融合到表达载体histag开放阅读框架（ORF）内。

1.2.5 目的基因在大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）中的诱导表达

将含有空载体pET19或目的基因重组表达载体的大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）分别接入50μg·mL-1Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜；将上述3种菌分别接入100 mL LB中，37℃培养2.5 h至OD600为0.6，取1 mL菌液作未诱导对照；添加终浓度为1 mmol·L-1的IPTG，28℃诱导6 h。取1 mL上述3种菌液作为诱导后样品；将剩余3种菌体用PBS（pH 7.2～7.4）缓冲液清洗2次，重悬菌体，并加入PMSF、Triton X-100和适量DNAase；最后冰浴中超声波破碎至菌液澄清（超声具体参数为10%Hz，工作时间20 min，每次超声2 s，间隔时间1.5 s）；取破碎液离心，收集上清及沉淀。上清作为可溶性蛋白样品，沉淀用等体积缓冲液重悬，作为不可溶性蛋白样品。以上所有样品用于SDS-PAGE蛋白质电泳检测。

1.2.6 肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）中胞苷酸激酶（CMK）活性测定

测定CMK活性方法为双酶分析法[12]，原理如下：

其中，pyruvate-丙酮酸；lactic acid-乳酸；PK pyruvate kinase-丙酮酸激酶；LDH lacate dehy⁃drogenase-乳酸脱氢酶。NADH在340 nm有最强吸收峰，可根据反应前后NADH含量变化，间接计算CMK活性。

具体步骤为：混合NADH各管溶液，测定各管溶液在340 nm处吸光值，制定NADH标准曲线，根据酶活力定义在5 mL离心管中加入3 mL反应体系，体系包含：100μmol·L-1CMP，1.5 mmol·L-1MgCl2，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4），5 mmol·L-1KCl，0.2 mmol-1PEP，0.2 mmol-1NADH，pyruvate kinase 1.5 U，lactate dehydrogenase 1.5 U，1.0 mmol·L-1ATP，加入适量CMK粗酶液；37℃反应1 h，98℃水浴5 min终止反应。作3个平行重复；调零，测定不加入CMK粗酶液反应体系的A340吸光值，再测定加入CMK粗酶液反应体系在0和60 min时的A340吸光值。

2 结果与分析

2.1阳性克隆筛选

Sau3AI不完全酶切NEAU-ST10-25T基因组后，胶回收4～10 kb片段，与被BamHI酶切并去磷酸化的pUC18载体连接，将连接产物电转至大肠杆菌（E.coli）KNabc感受态细胞中，最后在含有0.2 mol·L-1NaCl的LBK培养基中筛选，获得一个重组质粒，命名为pUC-LYS1。

2.2pUC-LYS1中外源DNA片段序列分析

如图1所示，重组质粒pUC-LYS1中外源DNA片段长6 772 bp，由1个N端截短ORF1、3个完整ORF（ORF2-4）及1个C端截短ORF5组成。其中，N端截短的ORF1（1～948）长947 bp；ORF2（956～2045）长1 089 bp；ORF3（2059～4366）长2 307 bp；ORF4（4 358～5 045）长687 bp；截短ORF5（5 234～6772）长1 538 bp。经过比对，N端截短的ORF1与盐单胞菌属（Halomonas sp.）TD 01中3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶（3-phosphoserine/phos⁃phohydroxythreonine aminotransferase）同源性最高（93%）；ORF2与南极碱盐单胞菌（H.alkaliantarcti⁃ca）中预苯酸脱水酶（Prephenate dehydratase）同源性最高（97%）；ORF3与南极碱盐单胞菌（H.alkaliant⁃arctica）中双功能的预苯酸脱氢酶/3-磷酸莽草酸-1-羧乙烯转移酶（Bifunctional prephenate dehydroge⁃nase/3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase）同源性最高（94%）；ORF4与伸长盐单胞菌（H.en⁃longata）中胞苷酸激酶（cytidylate kinase,CMK）同源性最高（86%），为便于区分其同源物，编码ORF4的基因cmk因其来自肇东盐单胞菌（H.zhaodongen⁃sis）被定名为Hz_cmk。；C端截短的ORF5与湛江盐单胞菌（H.zhanjiangensis）中核糖体蛋白S1（30S ri⁃bosomal protein S1）同源性最高（99%）。

2.3Hz_CMK的氨基酸序列分析及同源性比较

如图2A所示，Hz_CMK含229个氨基酸残基，相对分子质量24,610.9，等电点pI 5.62。在Hz_CMK氨基酸组成中，以Ala残基含量最高（35/229），其次分别为Leu（30/229）、Arg（21/229）、Asp（18/229）、Gly（16/229），Asn、His、Trp、Met含量较低。

图1 重组质粒pUC-LYS1中外源DNA片段结构Fig.1 Mapping of the inserted DNA fragment in the recombinant plasmid pUC-LYS 1

图2 肇东盐单胞菌胞苷酸激酶Hz_CMK的氨基酸序列及其同源性比对Fig.2 Deduced amino acid sequence of cytidylate kinase,Hz_CMK,from Halomonas zhaodongensis, together with alignment of Hz_CMK with its homologs

同源性比对分析表明，Hz_CMK与伸长盐单胞菌（H.enlongata）中推测的He_CMK同源性最高（86%）。符合Hz_cmk克隆自盐单胞菌属（Halomonas）的事实。由于He_CMK为推测蛋白，将Hz_CMK与其他已鉴定CMK蛋白作同源比对。结果如图2B所示，Hz_CMK与来自大肠杆菌（E.coli）的Ec_CMK、来自霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的Vc_CMK、来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）的Bs_CMK和来自结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的Mt_CMK同源性分别为55%、52%、39%和37%。根据同源性比对结果，可初步判断Hz_cmk编码胞苷酸激酶。

2.4Hz_cmk和Ec_cmk克隆载体和表达载体构建

分别以重组质粒pUC-LYS1和大肠杆菌（E.coli）K12基因组DNA为模板，PCR分别扩增Hz_cmk与Ec_cmk基因，通过T-A克隆方法将PCR产物克隆至pEASY-T3载体，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞获得阳性克隆，经测序验证二者均与原序列一致。为验证两个基因是否具有胞苷酸激酶功能，将Hz_cmk与Ec_cmk构建至表达载体pET19-pphistag，转化大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）感受态细胞，经PCR扩增、双酶切及测序验证，Hz_cmk与Ec_cmk均成功融合到表达载体histag开放阅读框架（ORF）内。转入表达载体的大肠杆菌（E.coli）C41（DE3），分别命名为C41（DE3）/pET-Hz_cmk和C41（DE3）/pET-Ec_cmk。转入空载体pET19-pp-his-tag的大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）命名为C41（DE3）/ pET19。

2.5Hz_cmk和Ec_cmk在大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）中诱导表达

为鉴定Hz_cmk和Ec_cmk是否表达，分别IPTG诱导C41（DE3）/pET-Hz_cmk和C41（DE3）/ pET-Ec_cmk，并在诱导前后取样，将样品与相应细胞破碎后上清和沉淀样品作SDS-PAGE凝胶电泳。SDS-PAGE显示，C41（DE3）/pET-Hz_cmk（图3A）和C41（DE3）/pET-Ec_cmk（见图3B）在28 ku附近均出现一条明显粗带，与预测Hz_CMK或Ec_CMK蛋白的分子质量28 ku接近，表明Hz_cmk和Ec_cmk基因在大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）中被高效诱导表达。此外，在C41（DE3）/pET-Hz_cmk（图3A）或C41（DE3）/pET-Ec_cmk（见图3B）细胞破碎后上清液中出现同样大小且浓度相近粗带，表明诱导表达的Hz_CMK或Ec_CMK蛋白大部分可溶，证明在大肠杆菌（E.coli）C41（DE3）中异源表达后，Hz_CMK或Ec_CMK蛋白正确折叠且具有活性。

图3 Hz_cmk与Ec_cmk在大肠杆菌中诱导表达及蛋白可溶性分析Fig.3 Expression and solubility analysis of Hz_cmk and Ec_cmk in E.coli C41(DE3)

2.6胞苷酸激酶酶活测定

用双酶分析法测定胞苷酸激酶活性，NADH标准曲线（见图4A）。测定反应过程中NADH在340 nm处吸光值，通过曲线计算NADH含量。最后间接计算胞苷酸激酶活性。为鉴定Hz_cmk是否编码胞苷酸激酶，利用C41（DE3）/pET19细胞提取物作为负对照，C41（DE3）/pET-Ec_cmk细胞提取物作为正对照，测定C41（DE3）/pET-Hz_cmk细胞提取物酶活性。如图4B所示，与C41（DE3）/pET19（负对照）细胞提取物未检测到胞苷酸激酶活性，C41（DE3）/pET-Hz_cmk细胞提取物检测到与C41（DE3）/pET-Ec_cmk细胞提取物（正对照）相似酶活性，表明Hz_cmk编码胞苷酸激酶。为进一步确定该结果，试验选取含不同量C41（DE3）/pETHz_cmk和C41（DE3）/pET-Ec_cmk细胞提取物，在相同反应时间测定胞苷酸激酶酶量对该酶反应速率影响。结果表明，随细胞提取物增加，胞苷酸激酶活性显著提高，且在酶量400μg时，酶活性达到饱和（见图4C），进一步证实Hz_cmk编码胞苷酸激酶。

图4 胞苷酸激酶酶学分析Fig.4 Enzymatic analysis for cytidylate kinase

3 讨论与结论

在大肠杆菌（E.coli）、霍乱弧菌（V.cholerae）、枯草芽胞杆菌（B.subtilis）和结核分枝杆菌（M.tuber⁃culosis）等非嗜盐菌中，胞苷酸激酶（CMK）已被鉴定为嘧啶核苷酸代谢关键酶，在生物大分子RNA，DNA和磷脂合成中具有重要作用[8-9]。在探索一株中度嗜盐菌-肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）NEA U-ST10-25T耐盐碱机制过程中，采用基因文库与大肠杆菌（E.coli）Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc[11]结合技术，克隆一个编码胞苷酸激酶的基因Hz_cmk。本文基因Hz_cmk的克隆与功能鉴定结果证实，该基因编码胞苷酸激酶。为国内外首次报道中度嗜盐菌胞苷酸激酶基因克隆与功能分析。

目前，CMK活性测定多采用分光光度法，总反应式为：CMP+PEP+NADH CDP+lactic acid+ NAD+。在整个反应体系中，除含有CMK外，包括PK和LDH，又称双酶分析法[12]。NADH在340 nm下有特征吸收峰，反应中NADH被氧化为NAD+，可通过检测NADH含量反映CMK酶活性。为验证该方法可靠性，本文利用C41（DE3）/pET19细胞提取物作为负对照，C41（DE3）/pET-Ec_cmk细胞提取物作为正对照。通过验证，发现C41（DE3）/ pET19（负对照）细胞提取物未检测到胞苷酸激酶活性，而C41（DE3）/pET-Ec_cmk细胞提取物（正对照）检测到较高酶活性，表明该方法切实可行。C41（DE3）/pET-Hz_cmk细胞提取物检测到与C41（DE3）/pET-Ec_cmk细胞提取物（正对照）相似酶活性，表明Hz_cmk编码胞苷酸激酶。由于酶活性仅为特定酶量下的酶学分析，结果可靠性需进一步验证。因此，本文取不同含量C41（DE3）/pET-Hz_cmk和C41（DE3）/pET-Ec_cmk细胞提取物，在相同反应时间测定胞苷酸激酶酶量对该酶反应速率影响。结果表明，随着细胞提取物增加，胞苷酸激酶活性显著提高，酶量400μg时，酶活性达到饱和，证实Hz_cmk编码胞苷酸激酶。

目前，仍未见胞苷酸激酶参与细菌耐盐碱过程相关报道，仅发现胞苷酸激酶催化CMP生成CDP，产物CDP可能参与细菌体内诸如磷脂合成等代谢途径[8-9]。在盐胁迫下，甘氨酸甜菜碱可影响微生物体内离子分布，稳定胁迫下微生物体内大分子，调节微生物对盐胁迫环境适应[13-14]。磷脂酰胆碱已被证实参与磷脂合成途径，该物质为甘氨酸甜菜碱前体物质，推测Hz_CMK可能通过合成CDP参与磷脂合成，影响甘氨酸甜菜碱合成量实现肇东盐单胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T对盐碱响应。今后将通过基因敲除方法，敲除磷脂合成途径等有关基因，研究分析其突变株合成甘氨酸甜菜碱量变化，以验证Hz_CMK是否通过合成CDP参与磷脂合成产生耐盐碱作用。

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Cloning and functional analysis of cmk encoding cytidylate kinase in Halomonas zhaodongensis/

JIANG Juquan,YANG Lina,LIU Yanshuang,SUN Kaifu
(SchoolofLife Sciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China)

In order to explore the halo-alkaline-tolerant mechanism of the moderate halophile Halomonas zhaodongensis NEAU-ST10-25T,genomic DNA was screened from this strain by selection in Escherichia coli KNabc lacking three major Na+/H+antiporters.One recombinant plasmid designated pUC-LYS1 enabled E.coli KNabc to grow in the presence of 0.2 mol·L-1NaCl. Sequence analysis showed that one N-terminal ORF1,three intact ORF(ORF2-4)and one C-terminal ORF5 are included in the DNA sequence inserted in the recombinant plasmid pUC-LYS1.Of three intact ORFs,ORF4 had the highest identity of 86%with a putative cytidylate kinase(CMK)from Halomonas enlongata.For the convenience of differentiation of its homologs,the gene cmkencoding ORF4 from H.zhaodongensis was designated Hz_cmk.Hz_CMK has also the higher identity with its homologs including the identified Ec_CMK from E.coli.In order to determine whether it encodes a cytidylate kinase,Hz_cmk,as well as Ec_cmk from E.coli as a positive control, was respectively constructed into a prokaryotic expression vector,pET19,and then transformed into the competent cells of E.coli C41(DE3),followed by the induction by with isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG).SDS-PAGE showed that Hz_CMK or Ec_CMK was overexpressed in E. coli C41(DE3)and soluble analysis also showed that either of them is present mostly in a soluble form,revealing that Hz_CMK or Ec_CMK should be functional in E.coli.Finally, enzymatic assay showed that Hz_CMK,as well as Ec_CMK,displayed the cytidylate kinase activity.To the best of our knowledge,this is the first report on the cloning and functional analysis of the cytidylate kinase gene from the moderate halophile.

Halomonas zhaodongensis;cytidylate kinase(CMK);prokaryotic expression; enzymatic activity

Q933

A

1005-9369（2017）07-0033-08

时间2017-7-12 11:19:42[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170712.1119.010.html

姜巨全,杨立娜,刘艳双,等.肇东盐单胞菌中胞苷酸激酶基因cmk的克隆与功能分析[J].东北农业大学学报,2017,48(7):33-40.

Jiang Juquan,Yang Lina,Liu Yanshuang,et al.Cloning and functional analysis of cmk encoding cytidylate kinase in Halomonas zhaodongensis[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(7):33-40.(in Chinese with English abstract)

2017-05-02

国家自然科学基金面上项目（31570045）；黑龙江省自然科学基金面上项目（C201417）；黑龙江省博士后科研启动金（LBHQ14022）

姜巨全（1977-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为分子微生物学与生物技术制药。E-mail：jjqdainty@163.com