不同抗寒性小麦品种分蘖节低温抗氧化效应分析

李卓夫，宋永超，陈露，王晓楠，付连双，刘鑫

不同抗寒性小麦品种分蘖节低温抗氧化效应分析

李卓夫，宋永超，陈露，王晓楠，付连双，刘鑫

（东北农业大学农学院，哈尔滨150030）

冷冻逆境中清除活性氧（ROS）对小麦抗寒性具有重要作用。文章采用3个抗寒性不同小麦品种（东农冬麦1号、济麦22和中国春），通过人工冷冻和田间越冬试验，分析不同冷冻温度下分蘖节中抗氧化物及H2O2、MDA变化，结果表明，随着温度下降，分蘖节H2O2含量持续上升，抗寒性强小麦品种H2O2含量较低；在＜-10℃之前MDA含量快速上升，表现应激反应，降低至较低水平，深度冷冻时含量上升，抗寒性强品种MDA含量低于不抗寒品种；分蘖节中POD酶活性和GSH含量在较高水平持续时间长，抗寒品种高于不抗寒品种；SOD和CAT酶活性均快速上升后持续降低，CAT酶活性品种间差异显著（P＜0.05）；在APX酶活性与ASA含量上，品种间差异在田间试验中保持至12月14日。H2O2含量持续上升与CAT和SOD酶活性下降有关。各抗氧化物质均可防止脂质过氧化，利于增强小麦抗寒性。小麦抗氧化物质遗传差异可作为培育强抗寒冬小麦品种选择依据。

小麦品种；抗寒性；抗氧化物质；H2O2；持续冷冻

冬小麦较春小麦增产潜力高、稳产性好，但高寒地区冬小麦种植，须大幅度提高品种抗寒性。增强品种越冬期间活性氧（ROS）清除能力对提高小麦品种抗寒能力具有重要作用。低温胁迫可增加植物体内活性氧积累[1-2]。ROS包括超氧阴离子（O2-）、羟基自由基（OH）和过氧化氢（H2O2）等，其中H2O2是低温胁迫中ROS主要成分[3]。低含量过氧化氢作为信号可调控生长发育、启动胁迫应答；积累量过高，对植物体内生物大分子及器官造成氧化损伤，诱导植物细胞程序性死亡[3-4]。活性氧可造成膜脂过氧化损伤，产生丙二醛（MDA）等代谢产物[5]。

植物抗寒性依赖活性氧清除系统，包括酶类物质[6-7]（如过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氧抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）等）和非酶类物质[8]（如抗坏血酸（ASA）、谷光甘肽（GSH）、维生素E和类胡萝卜素等）。SOD、CAT和APX是重要活性氧清除酶，低温下抑制抗氧化酶活性[7,9]。冯玉磊等研究表明低温胁迫下冬小麦丙二醛含量增加，低返青率品种更明显，SOD活性、ASA和GSH含量与MDA含量呈负相关[10]。拔节期遇低温小麦叶片SOD、POD和CAT活性呈先升后降趋势[11]。封冻期抗寒冬小麦品种中非酶类活性氧清除物质GSH和ASA含量可作为冬小麦品种抗寒性评价指标[12]。

目前冬小麦抗氧化方面研究多集中在活性氧清除系统或小麦其他时期活性氧清除酶活性和非酶类物质相互间关系[7-8]。关于封冻期分蘖节活性氧清除物质与活性氧含量间关系研究报道较少。本研究以3个抗寒性不同小麦品种为材料，分别在人工冷冻和田间自然越冬条件下测定小麦品种分蘖节中MDA、H2O2、GSH和ASA含量，SOD、POD、 APX和CAT活性，探讨冷冻逆境下不同抗寒性小麦品种间抗氧化物质与H2O2及MDA含量动态变化和差异，分析抗氧化物质与H2O2、MDA关系，研究小麦抗氧化能力提高内在机制，为强抗寒冬小麦品种培育提供依据。

1 材料与方法

1.1材料及处理

试验选取3份抗寒性不同小麦品种，分别为强抗寒冬小麦品种“东农冬麦1号”（东北农业大学小麦育种所培育，越冬返青率高于85%）、弱抗寒冬小麦品种“济麦22”（山东省农科院培育，黑龙江等高寒地区无法种植越冬）和不抗寒春小麦品种“中国春”（黑龙江冬季无法越冬）。采用3种冷冻试验，即田间自然越冬、人工快速冷冻和人工持续冷冻试验。

1.1.1 田间低温驯化期和封冻期取材

将3个品种于2015年9月3日播种于东北农业大学校内试验田。采用完全随机试验设计，每品种播种20行，行长5 m，株距2 cm，行距30 cm。每个取样时间点各品种取样30株，取3次重复。3个品种均于2015年9月22日出苗，待3叶1心期每隔15 d取样1次，取样日期分别为2015年10月15日、10月30日、11月14日、11月29日、12月14日、12月29日、1月13日，共7次，对应日平均温度分别为13、-2、-2.5、-11.5、-12、-19和-22.5℃（见图1）。将取出植株清洗泥土，吸干水分，去除根部及叶片，留取分蘖节至基部叶部约2 cm处组织，-20℃保存备用，人工冷冻试验植株同此处理。

1.1.2 室内冷冻试验设计与取样

于2015年6月至2016年1月东北农业大学农学院小麦实验室作盆栽冷冻试验。选取“东农冬麦1号”“济麦22”和“中国春”饱满种子，以行距4 cm，株距3 cm，种植于白色塑料盆中，盆规格为60 cm× 30 cm×15 cm，放置于人工气候箱中培养。光照强度2 000 lx，温度和光周期为（昼）25℃12 h/（夜）18℃12 h。幼苗生长至3叶1心期时将盆移至低温光照培养箱中冷驯化处理，最大光照强度2 000 lx，温度和光周期为（昼）10℃16 h/（夜）4℃8 h，冷驯化30 d后移至冰箱冷冻处理。

人工冷冻分为快速冷冻（处理Ⅰ，见表1）和持续冷冻（处理Ⅱ，见表2），各设5个冷冻温度,每个温度取3次重复。

图1 大田试验取样时期及气温变化Fig.1 Field test sampling period and temperature change

表1 处理Ⅰ样品编号及处理Table 1 TestⅠsample number and treatment

表2 处理Ⅱ样品编号及处理Table 2 TestⅡsample number and treatment

1.2生理指标测定

丙二醛（MDA）测定参照文献[13]中硫代巴比妥酸方法：三氯乙酸（TCA）研磨匀浆，4℃8 000 g离心10 min，吸取2 mL提取液上清，3次重复。加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，对照加2 mL 10% TCA，摇匀后于沸水中煮15 min，迅速置冰上终止反应，4℃离心，取上清液测定450 nm波长下吸光度值。

过氧化氢（H2O2）含量测定参考文献[14]方法：取0.5 g冬小麦分蘖节，加入6 mL 5%（W/V）三氯乙酸匀浆研磨，4℃，10 000 r·min-1离心10 min，取1 mL上清酶提取液，加入0.1 mL 20%四氯化钛浓盐酸溶液和0.2 mL浓氨水，混合后18 000 r· min-1离心10 min，1 mol·L-1浓硫酸溶解沉淀后测定410 nm处吸光值，3次重复；

过氧化物酶（POD）活性测定参考文献[15]方法：取0.5 g冬小麦分蘖节，加入3 mL磷酸缓冲溶液（PBS）匀浆研磨，2 mL PBS混匀。4℃，10 000 r·min-1离心20 min，取上清液为SOD粗酶提取液，3次重复。取4支透明试管，2支作为对照，测定组依次加入1.5 mL PBS、0.3 mL甲硫氨酸、0.3 mL氮蓝四唑、0.3 mL磷酸氢二钠、0.3 mL核黄素、0.05 mL SOD粗酶提取液以及0.25 mL蒸馏水，反应总体系3 mL，对照组采用PBS溶液代替SOD粗酶提取液，另外1支仅加缓冲液，用于调零。混匀后，调零试管置于暗处，另外3支试管置于4 000 lx光照，25℃下反应30 min。反应结束后，黑布遮住各试管终止反应，黑暗处以CK管调零，分别测定560 nm处吸光值。

超氧化物歧化酶活性（SOD）测定参考文献[15]方法：取0.25 g分蘖节材料于研钵中，加2 mL PBS研磨成匀浆，4 000 r·min-1离心15 min，移上清至25 mL容量瓶中，多次清洗残渣重复上述操作，PBS溶液定容，3次重复。加入反应混合液3 mL和1 mL PBS作为对照，加入混合液3 mL和酶液1 mL为测定组。立即计时，测定470 nm下吸光值，每分钟读数1次。

过氧化氢酶（CAT）活性测定参考文献[15]方法：取0.5 g样品，加入2.5 mL PBS（pH=7.8）匀浆研磨，再加入2.5 mL PBS混匀，4℃，15 000 r·min-1离心15 min，取上清液备用，3次重复。加入3% H2O21 mL和H2O 1.95 mL，再加入0.05 mL酶提取液启动反应。测定240 nm处吸光值的降低速度，测定1次·min-1，共4次，以每分钟吸光值减少0.01定义为1个酶活力单位。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定采用文献[16]方法：取0.25 g样品液氮充分研磨，加入5 mL预冷PBS研磨匀浆，4℃，20 000 r·min-1离心15 min取上清，-20℃下保存备用，重复3次。酶反应体系中包含50 mmol·L-1PBS（pH 7.0），0.1 mmol·L-1的EDTA-Na2，0.3 mmol·L-1ASA。每3 mL反应液加入0.1 mL粗酶提取液，最后加入H2O2（20μL 90 mmol·L-1）启动反应。10 s开始测定吸光值，每10 s读数1次，测定10 s～60 s吸光值。

抗坏血酸（ASA）含量测定参考文献[17]方法：取0.3 g分蘖节在5 mL预冷6%TCA溶液中研磨匀浆，2℃，15 600 r·min-1离心10 min，取上清液备用，3次重复。取1 mL上清酶液，加入1.0 mL 5% TCA 1.0 mL乙醇，0.5 mL 0.4%磷酸-乙醇，1.0 mL 0.5%BP-乙醇，0.5 mL 0.03%三氯化铁三氯化铁-乙醇，总体积5 mL。混匀后于30℃水浴90 min，测定525 nm处吸光值。根据标准曲线计算样品中ASA含量。

GSH测定参考文献[18]方法：取0.3 g冬小麦分蘖节于5 mL预冷7%磺基水杨酸溶液研磨匀浆，3次重复，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。在0.1 mL上清酶提取液中加入2.0 mL 0.2 mol·L-1的PBS（含EDTA，pH 7.2）溶液，0.3 mL 0.2 mmol·L-1NADPH，0.3 mL 1U谷胱甘肽还原酶，0.3 mL 1 mmol·L-1DTNB溶液，置于27℃水浴30 min后测定412 nm处吸光值。根据标准曲线计算样品GSH含量。

1.3数据分析

采用Excel 2007和DPS 7.05软件作数据处理，Office PowerPrint 2007和Excel 2007完成图片和表格绘制。

2 结果与分析

2.1低温下过氧化氢含量动态变化

本研究检测低温试验中各处理不同小麦品种分蘖节中H2O2含量，结果见图2，三个低温处理试验中各品种H2O2含量间差异显著（P＜0.05），随着冷冻温度下降各品种H2O2含量持续升高，但升高幅度不同，表现为品种抗寒性越强，H2O2含量越低。快速冷冻和持续冷冻试验中，三个品种H2O2含量变化幅度为0.65～5.76μmol·g-1FW，大田试验中变化幅度为2.56～12.33μmol·g-1FW；深度冷冻与冷冻前H2O2含量比较发现，中国春和济麦22远高于东农冬麦1号，快速冷冻处理下中国春、济麦22和东农冬麦1号分别增加7.78、8.09和5.46倍；持续冷冻处理下三品种分别增加7.09、7.74和4.83倍；大田试验中，三品种分别增加4.82、4.14和3.75倍。

结果表明，在低温冷冻条件下，冬小麦分蘖节中H2O2含量虽持续升高，但不同抗寒性品种间在过氧化氢积累量和增加幅度上差异显著（P＜0.05），表现为抗寒性越强品种，H2O2积累量越少；而与非冷冻处理相比，深度冷冻时抗寒性越强品种，H2O2增加幅度越小。

图2 不同品种间H2O2含量变化Fig.2 Changes of H2O2content in different varieties

2.2低温下丙二醛含量动态变化

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化产物，反映植物逆境胁迫后机体受活性氧损害程度，本研究采用丙二醛作为冷冻条件下植株受伤害程度指标，结果见图3。图3中与大田试验结果不同，快速冷冻和持续冷冻处理下，三个品种MDA含量变化范围为10～35μmol·g-1，而在大田试验中，丙二醛含量变化范围为3～33μmol·g-1。在田间封冻初期各品种丙二醛含量较低，而在-10℃下,各品种丙二醛含量均快速升高，为小麦对较低温应激反应；随冷冻温度继续下降，不同抗寒性品种间丙二醛含量差异逐渐加大，品种间显著差异出现在1月13日，日平均气温降至-22.5℃时。在深度冷冻情况下，抗寒品种丙二醛含量低。在快速冷冻和持续冷冻处理下，东农冬麦1号丙二醛含量在低值水平上缓慢上升，中国春在高值水平上缓慢上升，而济麦22则由低值到高值快速上升。丙二醛含量反映低温胁迫下品种间膜脂损伤程度和修复程度差异，结果表明抗寒品种膜受损伤程度低，损伤后修复较快。

图3 不同品种间的丙二醛含量变化Fig 3 Changes of MDA content in different varieties

2.3低温大田试验中抗氧化物质含量变化与H2O2、MDA关系

由图2、3结果可知，不论快速冷冻还是持续冷冻试验，过氧化氢含量变化与田间试验趋势一致，而丙二醛含量变化存在差异。田间试验结果可更准确反映品种差异，本研究分别检测田间不同时期各品种分蘖节抗氧化物质（POD、APX、SOD、CAT、ASA和GSH）含量，结果见图4。

图4h中MDA含量说明膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应程度，抗氧化酶活性和非酶类抗氧化物质含量变化与MDA关系可反映抗氧化物质对膜系统保护及损伤后修复作用。与图4h相比，图4a中，品种抗寒性越强，POD酶活性越高，丙二醛含量越低。冷冻温度越低，品种间差异越显著，说明过氧化物酶对防止膜脂过氧化具有重要作用。

由图4可知，随着冷冻温度降低，各品种CAT活性先升后降；SOD活性不断下降；GSH含量上越冬性品种高于中国春；ASA含量和APX酶活性上，东农冬麦1号变化幅度大，封冻中期高于不抗寒品种，APX酶活性动态变化与ASA变化相似。POD酶活性及GSH含量在抗寒品种中持续较高，APX酶活性及ASA含量在封冻中期保持较高水平。

综上可知，SOD活性随着冷冻温度下降而降低，由于SOD在歧化O2-产生H2O2反应中发挥作用，SOD活性降低使该途径中H2O2下降，而实际检测H2O2含量持续升高，说明在冷冻条件下，存在其他H2O2产生途径。冷冻程度对于H2O2清除酶（POD和CAT）活性具有强烈抑制作用，其活性降低必然影响H2O2清除效果。POD和CAT活性在11月29日（-11.5℃）之前保持较高水平，但不足以完全清除H2O2。在冷冻温度为-12～-23℃区间，随着温度降低，POD和CAT活性持续降低，不利于H2O2清除。GSH和ASA含量及APX活性变化与过氧化氢关系不明显，但不同品种间差异上，APX活性及ASA和GSH含量与MDA含量在12月14日（-12℃）后关系密切，品种APX活性强，ASA及GSH含量高，MDA含量低，东农冬麦1号尤为明显；中国春品种APX活性低，ASA和GSH含量越低，MDA含量越高，说明APX、ASA和GSH对膜脂抗氧化具有重要作用。

图4 田间试验中抗寒指标变化Fig.4 Changes of cold-resistance index in field test

3 讨论与结论

封冻期冬小麦分蘖节产生ROS主要部位为线粒体和过氧化氢酶体，H2O2存在时间远长于O2-[19]。因此，冷驯化条件下可检测H2O2大量积累[20]。但同类研究中多以MDA等作为抗寒指标。随着冷冻温度持续下降，不同抗寒性小麦品种在H2O2含量变化上均表现持续上升趋势，随着冷冻程度加剧品种间H2O2含量差异幅度增加。与预期不同，不同越冬性品种在H2O2含量上，并未表现冷冻后随活性氧清除物质增加而下降趋势。与郑建树研究结果一致，佛手幼苗从25～45℃随温度升高H2O2含量持续上升[3]。说明在极端温度下植物可大量积累H2O2。H2O2是多途径产生活性氧类别，SOD歧化O2-反应、质膜NADPH氧化酶催化反应和过氧化物体脂肪酸β-氧化反应均产生大量H2O2[21]。低温条件下SOD在歧化O2-产生H2O2反应中发挥作用，但冷冻温度引起SOD活性降低并未使H2O2总含量下降。

POD和CAT是清除H2O2主要酶，但本研究中酶活性均受深度冷冻强烈抑制，不利于H2O2清除。不同抗寒性小麦品种间，POD和CAT活性高品种，H2O2含量较低，说明通过遗传改良，提高POD和CAT活性有利于降低H2O2含量，提高冬小麦抗寒性。CAT对H2O2亲和力较低，仅在H2O2含量较高时作用明显[22]。温度过低CAT活性受到抑制，即使H2O2浓度较高，CAT也难以发挥清除H2O2作用。H2O2含量调控过程复杂，抗氧化酶类及物质均有不同程度贡献，分析探讨相互间关系可为抗寒育种提供重要依据及抗逆思路。

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化重要产物，在遭遇低温损害时，抗寒性强品种MDA含量较低，抗寒性弱品种MDA含量较高[23]。冯玉磊等对冬小麦返青期分蘖节中SOD活性，MDA、ASA和GSH含量变化研究结果表明，冬小麦叶鞘中MDA含量在降温后增加，其含量与返青率呈正相关[10]。本研究中不同冷冻处理下MDA含量变化与H2O2不同，表现为轻度冷冻温度下MDA含量快速提高，品种间无差异。与齐代华等对长叶竹柏低温下MDA变化研究结果一致，属于低温应激反应，深度冷冻时，MDA含量大幅降低后逐渐上升，品种抗寒性越强其含量越低[24]。POD活性和GSH、MDA含量变化关系密切，表现为POD活性越强，GSH含量越高，MDA含量越低。提高品种POD活性和GSH含量，减轻活性氧对膜脂损伤，有利于增强小麦抗寒能力。深度冷冻条件下MDA含量也可作为选育强抗寒小麦品种重要依据。

正常情况下SOD活性越高，植物抗氧化能力越强。随着逆境持续时间延长或程度加剧，SOD活性表现多种动态特征，如一直下降、先降后升或者保持不变[25-26]。干旱逆境下水稻SOD、POD和APX活性随干旱持续时间延长而上升[27]。而本研究中，在低温胁迫下，SOD、CAT和APX酶活性呈先升后降或持续下降趋势，这与冬小麦及其冷冻温度有关，黑龙江地区冬季地表温度达-20℃以下。温度降至-10℃以下后抗氧化酶活性下降，与马光等对观赏羽衣甘蓝抗寒研究结果类似，-10℃为观赏羽衣甘蓝SOD活性调节临界值[28]。

结合本试验中各抗氧化物质与H2O2及MDA关系发现，综合运用遗传改良相关技术，包括分子生物学研究成果及基因工程技术，增强植株低温下抗氧化酶活性和非酶类物质高水平持续能力是提高冬小麦耐寒性有效途径。本研究揭示封冻期冬小麦分蘖节活性氧变化特征及抗氧化物质协同变化对清除活性氧、减轻活性氧对膜脂过氧化损伤作用。后续仍需检测更多相关生理指标，结合冬小麦封冻期转录组测序数据，从转录组水平上印证抗氧化物质关系，进一步挖掘潜在抗氧化功能基因，全面解析其ROS清除机制，为冬小麦耐寒性育种提供依据。

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Analysis of anti-oxidant effects of crowns in different freezing tolerant wheat cultivars under low temperature treatments/

LIZhuofu,SONG Yongchao, CHEN Lu,WANG Xiaonan,FU Lianshuang,LIU Xin
(School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

ROS scavenging played a significant role in wheat freezing resistant under freezing stress.Previous studies focused much on the changes of ROS scavenging agents,and few researches reported on.In this study,we applied artificial cold treatment in the experiment and natural overwintering treatment in the field to assay the variation of the antioxidants,H2O2and MDA among three wheat varieties(Dongnong-dongmai1,Jimai22 and Chinese Spring)under freezing stress.With the temperature decrease,the content of H2O2in the tillering node showed a steady rising trend,and the strong cold hardiness cultivar had lower H2O2compared to cold sensitive cultivar.MDA had a quick increase by cold stimulation upon-10℃,manifested as a stress and then desending to a lower level,and strong cold hardiness cultivar showed a lower content compared to cold sensitive cultivar when the temperature continually fell.POD enzyme activities and GSH content in the crown showed a higher level in strong cold hardiness cultivar than those in cold sensitive cultivar.The enzyme activities of SOD and CAT had a quickincrease then a decrease trend,and showed obvious differences among wheat varieties（P＜0.05）. APX enzyme activities and ASA content showed a distinct fluctuation among wheat varieties until Dec.14 in field test.These results indicated the increased H2O2had a relationship with the decreased enzyme activities of CAT and SOD.In addition,the antioxidants produced positive effect on avoiding lipid peroxidization,and had benefit on plant cold resistance.The differences among wheat varieties could be used as references for winter wheat breeding.

wheat cultivar;freezing tolerance;antioxidant agents;H2O2;extending freezing

S512.1

A

1005-9369（2017）07-0001-09

时间2017-7-12 11:19:27[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170712.1119.004.html

李卓夫,宋永超,陈露,等.不同抗寒性小麦品种分蘖节低温抗氧化效应分析[J].东北农业大学学报,2017,48(7):1-9.

LiZhuofu,Song Yongchao,Chen Lu,etal.Analysis ofanti-oxidant effects of crowns in different freezing tolerant wheat cultivars under low temperature treatments[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(7):1-9.(in Chinese with English abstract)

2017-04-14

黑龙江省博士后科研启动基金项目（LBH-Q14026）；东北农业大学学科团队项目

李卓夫（1957-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为小麦遗传育种，E-mail:zflicn@163.com