基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

刘 念，李玉红，2，郑恩金,高大庆，陆承平



基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

刘 念1，李玉红1，2，郑恩金1,高大庆1，陆承平3

目的 Eha是一个影响迟缓爱德华菌(Et)胞内生存的转录调控因子,本研究有助于揭示其调控Et抵御酸的分子机制。方法 用ATPase 抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化，菌落计数法比较酸化对野生株和eha基因缺失株胞内存活数目的影响；比较两种细菌在酸性应激实验中存活率的差异;构建pMP220-PehaLacZ质粒，采用β-半乳糖苷酶实验检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性；选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR验证其结果。结果 野生株ET13在巨噬细胞内和不同pH酸环境中的存活率明显高于缺失株，阻止酸化胞内菌数明显高于未阻止酸化的胞内菌数(P<0.05)。对数期细菌pH6.3培养基生长2 h，RNA-Sequencing结果表明：eha基因缺失株转录水平和野生株相比，147个差异显著表达的基因(DEGs)(|log2 Ratio|≥1)，其中113个上调，34个基因下调，qRT-PCR随机抽样，和RNA-Sequencing 表达趋势呈强相关。147个基因采用GO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份；基于KEGG通路的富集分析,有130个可以富集到55条通路中，包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径，涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。结论 在酸性生存环境，Eha对Et的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控。

eha基因；RNA-sequencing；E.tarda；酸化

迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda，简称Et)属于肠杆菌科爱德华菌属，该菌能够感染多种鱼类，是水产养殖业的重要病原体[1]。Et也可感染人，引起人的胃肠炎、腹膜炎、败血症和脑膜炎等疾病[2]。Et溶血调控基因(Et haemolysin activator gene，简称eha)是Et一个重要的毒力调控基因[3-4]，Et菌能够抵抗巨噬细胞吞噬体内氧化和酸化的杀菌而生存繁殖，是其致病的关键[5]，eha基因缺失引起Et 在巨噬细胞内繁殖率降低的机制[6],尚未完全研究清楚。高通量测序技术，具有测序通量高、成本低、速度快等特点，广泛应用于动植物及微生物的基因组学、转录组学等领域的研究。

近年来，随着新一代高通量测序技术(High-throughput sequencing technology)的发展，转录组测序(RNA sequencing，RNA-Seq)技术已成为测序技术的重要手段。本研究首先分析Eha在调控细菌抵御巨噬细胞酸化杀菌的作用，采用RNA-Seq比较在酸性条件下,ET-13野生株和eha基因缺失株转录组表达差异的基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)，通过生物信息学对其数据进行定性定量的分析，旨在分子水平识别DEGs的功能及其代谢通路，并利用荧光定量PCR随机抽样,验证DEGs表达趋势，初步探索Eha在调控Et抵御巨噬细胞酸化杀菌的分子机制。

1 材料与方法

1.1 Et毒力株 ET13为南京农业大学陆承平教授惠赠；ET13的eha基因缺失株为本室保存；鼠源巨噬细胞RAW264.7为上海兽医研究所王少辉博士惠赠;pMP220-PehalacZ质粒东南大学毛晓华教授惠赠。细菌培养基(Luria Broth，LB)：细胞培养液(Dulbecco’s Minimum Essential Medium，DMEM)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)均购自Gibco公司。

1.2 抑制酸化对细菌胞内存活的影响 方法参考文献[6]，实验组用含1 μmol/L ATPase 抑制剂洛霉素(Bafilomycin，BAF)A1的培养液处理细胞30 min，以阻止细胞吞噬体酸化，对照组用正常细胞培养液。对数期ET13野生株和eha缺失株以10∶1的感染复数 (Multiplicity Of Infection，MOI)分别加入24孔单层细胞。共孵育1 h后，再用含庆大霉素(100 μg/mL)的培养液杀胞外的细菌1 h，此时定为0 h；换用含庆大霉素(10 μg/mL)的培养液继续培养0 h，2 h，4 h 或 6 h。在预定时间点，加入1 mL 1% Triton X-100裂解细胞10 min，将裂解产物经稀释，涂平板,培养,菌落记数。以培养时间(h)为横坐标，活菌数(CFU/mL)为纵坐标，绘制细菌胞内细菌数目和时间曲线。

1.3 酸性环境的应激实验 方法参考文献[6],对数期的菌体用PBS(pH7.2)漂洗2次后，菌液 OD600调节为0.5。菌液分为两等份，一组为实验组,经不同pH(7.2，6.3，5.5，4.8,4.3)LB处理2 h，另一组作为对照组,正常培养。然后进行两组培养液系列稀释，涂平板，计数菌落。菌液浓度=平板菌落数/mL×稀释倍数，细菌存活率=实验组菌液浓度(CFU/mL)/对照组菌液浓度(CFU/mL)×100%。

1.4 构建eha基因的启动子和LacZ融合质粒及β-半乳糖苷酶实验 以ET13基因组DNA为模板,扩增eha的启动子区域,将该片段插入 pMP220-LacZ载体中,构建了eha基因的启动子探针载体pMP220-PehaLacZ，然后将该载体电极导入eha基因缺失株中，检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性，选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间。

1.5 提取细菌的RNA 野生株与eha基因缺失株分别在pH值7.2的LB培养至对数生长期(OD值0.8)，再在pH值6.3的LB培养2 h。分别提取两种细菌的RNA，并检测其浓度(μg/μL)和纯度(OD260/OD280，OD260/OD230)，及RNA完整性计数(RNA Integrity Number，RIN)。

1.6 cDNA文库的构建与Illumina测序仪测序 根据细菌mRNA纯化试剂盒的说明书提供的方法，将提取的总RNA中16S rRNA 与23S rRNA 除去，用带有Oligo T(dT)的磁珠对mRNA进行富集纯化。mRNA打断成100-500 nt短片段后逆转录成cDNA,3′末端加polyA并连接测序接头，连接产物经PCR扩增得到测序文库，上机进行 Illumina Hi Seq 2000 测序(深圳华大基因公司完成)。

1.7 转录组数据分析 测序所得的原始数据称为原始标签(raw read)，再进行过滤得到净标签(clean read)，用于后续分析。该序列信息已提交至NCBI Sequence Read Achieve数据库，登录号：SRX 1898774。

1.8 差异表达基因分析 利用短reads比对软件SOAPaligner/SOAP2 软件,将测序数据与E.tarda菌ATCC15947参考基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/)进行比对,统计clean reads 参考基因组及基因序列上的分布情况及覆盖度;利用 RPKM(Reads Per Kb per Million)法计算基因的表达量，用于比较两样品间基因的差异表达情况，以p-value做多重假设检验校正，通过控制错误发生率(false discovery rate，FDR)来决定P阈值;采用Gene Ontology(GO)数据库(http://www.geneontology.org/)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库(http://www. genome. jp/kegg/)进行差异表达基因的功能聚类和生物学功能分析。

1.9 实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR) 分别提取野生株与eha基因缺失株的RNA，随机选取RNA-seq差异显著15个基因,根据表1设计引物，操作按试剂盒说明书，反应在ABI7300型荧光定量PCR仪上进行，以16S rRNA基因的表达量作为内标参照，采用2-ΔΔct法计算eha基因缺失株的基因转录水平相对野生株的倍数,这些基因的表达趋势和RNA-seq表达的基因趋势做相关性分析。

表1 qRT-PCR引物序列,产物大小和变性温度

Tab.1 Primer sequence product size and annealing temperature for RT-qPCR

GenePrimersequence(5′→3′)Productsize/bpAnnealingtemperature/℃UpregulatedETATCC＿RS01560GCCAGCACAGGTGATCTCGGCGAGGATACGGACATGAGCC13459．50ETATCC＿RS01555TGGAGCCATTATCACTTTCGCGATCTGCGCTAATACCTCC15457．45ETATCC＿RS05005TGGGCGTCGGTGCCTTCTTCGCCATCGCCAACAGGAATAG16657．55ETATCC＿RS11570CTATCGCCAAACCCATTACCTCGTCACCGACTACAAACCA14155．40ETATCC＿RS13205TTCCTGCGGCACAGTTGAAGGCATTGGCTGATTGGTTG19058．00ETATCC＿RS14200TCTTCCAGCAGGGATTCGGGCTGGTCTTGGCTACCGTCA14759．50ETATCC＿RS11220GGTGGACGAGGCGTTCCTTCAATAGCGGCAGCGACAGC17262．00ETATCC＿RS10525CATTGGTGCGCCTGGAAGAACACGCCGATGGTGAACGT16860．00ETATCC＿RS09485TGGCGCTAGTGCAAGAACATACGGCATGGATGCTGACC15558．00ETATCC＿RS14205GCCATCTGGATCGGTAACTTCATCTCCTGCACATTGACGT16855．40DownregulatedETATCC＿RS16120TAGCTGATCCAGCGTCCTGGCGTTTGAAGCCGTTAGAG14558．00ETATCC＿RS06155ACTTTGCCGTGTTTGTCGCGCAGGGTTGAACAGCAGGA12458．00ETATCC＿RS11420TTGGATCTGGAGAAGGGTGCTGCAATGTTGTCGAGGAGT14258．00ETATCC＿RS00925TGACCGTGCGTGGTAATCCGCGGCTGTAGTGCTTCTGG18660．00ETATCC＿RS10185AACTTGGTCGGTTGGGATGGCTGTGACGGGAGTTAGGC12059．45

1.10 统计学分析 两组数据之间的比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。qRT-PCR基因的表达趋势和RNA-seq表达的基因趋势,用R2做相关性分析，R2>0.75表示强相关性，0.75>R2>0.45表示中等相关性，R2<0.45表示弱相关性。

2 结 果

2.1 比较抑制酸化对ET13野生株和eha基因缺失株在胞内存活的影响 从图1中可以看出，先用ATPase 抑制剂洛霉素A1处理巨噬细胞,以阻止酸化，再用野生株和eha基因缺失株分别感染RAW264.7细胞1 h，庆大霉素杀胞外菌1 h，继续培养4 h 或6 h时，它们胞内CFU/mL明显高于各自未阻止酸化的胞内CFU/mL(P<0.05)，表明巨噬细胞的酸化在抑制Et胞内繁殖中起了很大作用,但酸化对野生株和缺失株各自抑制程度明显不同。继续培养6 h时，未阻止酸化野生株胞内CFU/mL和未阻止酸化eha基因缺失株胞内CFU/mL差异明显(P<0.05)，这说明eha基因在调控细菌抵御巨噬细胞酸化杀菌中起了重要作用，但同时,阻止酸化野生株胞内CFU/mL和阻止酸化eha基因缺失株胞内CFU/mL差异也明显(P<0.05)，这也说明eha基因在调控细菌抵御巨噬细胞杀菌中其它机制也起作用,如我们以前的研究表明,Eha蛋白能够调控Et 抵抗Mф 氧化杀菌的作用[6]。

图1 比较酸对野生株和eha基因缺失株巨噬细胞胞内存活的不同影响Fig.1 Comparison of the differences of the intracellular survival rates of the wild type and its eha mutant in macrophages against acid

2.2 比较经不同pH LB处理,野生株和eha基因缺失株存活率的差异 模拟细菌在巨噬细胞吞噬溶酶体中酸性的环境，对数期细菌经不同pH(7.2，6.3，5.5，4.8,4.3)LB处理细菌2 h后，结果如图2所示，eha基因缺失株的存活率明显低于野生株(P<0.05)，互补株的存活率介于缺失株和野生株之间。结果表明,eha基因在细菌在体外抵御酸的杀菌机制中起重要作用。

图2 比较不同pH酸对野生株和eha基因缺失株存活率的影响Fig.2 Comparison of the differences of the survival rates of the wild type and its eha mutant against different pH acid

2.3 检测eha基因的启动子在不同环境刺激下的转录活性 体外模拟在巨噬细胞酸的生存环境，分别在不同时间和pH值的LB培养Et菌，检测含pMP220-PehaLacZEt菌的β-半乳糖苷酶活性,结果表明，对数期的Et菌在pH值6.3的LB培养2 h，Eha转录水平最高。

2.4 转录组的测序数据评估 提取野生株与eha基因缺失株RNA浓度分别为1.905 μg/μL和1.255 μg/μL;纯度:OD260/OD280，≥1.9，OD260/OD230≥2.0；RIN：10.0,表明其纯度高,满足建库要求。为了构建Et菌的cDNA文库，其mRNA被随机性打断。其随机性评估表明,ET13菌野生株和缺失株转录组测序不同的长度的clean reads在基因组中分布均匀。利用软件将成功比对到基因组上的clean reads与参考基因序列进行比对，进行基因覆盖度分析，结果表明，野生株和eha基因缺失株的clean reads中覆盖率在90%以上的基因分别超过92%。

2.5eha基因缺失株和野生株差异表达基因比较和功能聚类分析 利用RPKM法计算两种细菌基因的表达量,阈值设为:|log2 Ratio|≥1,FDR≤0.001。在ET13野生株中，共有147个基因的转录水平与eha基因缺失株相比差异显著，其中113个基因转录水平上调，34个基因转录水平下调。采用GO数据库对147个差异表达的基因进行功能聚类分析,分成25类,这些基因主要涉及细胞加工(68个)、定位(30个)、结合(59个)、催化(83个)、运输 (27个)、代谢 (78个)、细胞成份(37个)和细胞膜(33个) (图3)，Eha在酸性条件下调节这些基因。

基于KEGG通路的显著性富集分析,能确定DEGs参与的最主要生化代谢途径和信号转导途经。结果显示，147个DEGs中，有130个基因可以富集到55条通路中，包括10条与氨基酸代谢相关的路径，16条与碳代谢、脂质、酯酸及能量代谢相关的路径，4条与核苷酸代谢相关的路径，3条与硫代谢相关的路径，以及一些与氮代谢、铁的转运等相关的路径。涉及差异表达基因较多的代谢路径主要有(|log2 Ratio|≥1) (表2)：双组分系统路径(20个)，ABC转运系统路径(12个)，不同环境中的微生物代谢路径(21个)和次代谢的合成路径(17个)。

2.6 实时荧光定量PCR 随机选取 15个DEGs进行qRT-PCR,验证RNA-seq测结果。两种方法结果表明，14个基因的表达趋势出现了一致的结果，其相关性为强相关(R2=0.799>0.75)，仅ETATCC-RS11570基因在eha基因缺失株和野生株中通过qRT-PCR检测无明显差异，与RNA-seq结果不一致(图4)。

图4 比较qRT-PCR和RNA-seq发现的差异表达基因Fig.4 Comparison of significantly different expressed genes by qRT-PCR和RNA-seq

Classification of DEGs between the wild type and the eha mutant，according to GO functional analysis (|log2 Ratio|≥1).图3 ET 13 eha基因缺失株和野生株差异表达基因比较和聚类分析Fig.3 Classification of significantly different expressed genes between the wild type and its eha mutant of ET 13

3 讨 论

本研究首先用洛霉素A1抑制酸化和菌落计数法,比较酸化对ET13株和它的eha基因缺失株胞内存活数目的影响,以及比较两种细菌在体外酸性应激实验中存活率的差异,发现了Eha在调控Et菌抵御巨噬细胞酸化杀菌和体外酸性环境中的重要作用。然后，采用β-半乳糖苷酶实验检测eha的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性；选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Seq，比较ET13株和eha基因缺失株的转录组表达,发现了147个DEGs，对它们进行GO功能聚类和KEGG通路分析，结果如下：

为了生存和适应外界环境，细菌通过双组分系统(Two-component system，TCS)等信号转导途径来响应环境信号并对刺激作出应答。本研究提示，20个DEGs涉及TCS系统路径。在酸压力下,eha基因缺失株中有7个DEGs上调，13个DEGs下调。ETATCC_RS06140、ETATCC_RS06135 和ETATCC _RS06130分别编码柠檬酸裂合酶CitC的α、β、γ亚基，ETATCC_RS06145和ETATCC_RS06150编码CitG亚基。柠檬酸裂合酶是参与三羧酸循环的关键酶，已经报道，柠檬酸裂合酶基因突变的Et在感染鱼的模型中生存力和致病性明显下降[7]。ETATCC_RS14195和ETATCC_RS00005以及ETATCC_RS12655分别编码谷氨酰胺酶和丝氨酸脱水酶。幽门螺杆菌产生的谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺脱氨,中和胃酸，这和该菌在胃的生存能力和致病性有关[8]。ETATCC_RS16530编码一种外膜蛋白，它负责将荚膜多糖从周质间隙运输到菌体表面，而荚膜直接参与细菌对环境的抗逆性[9]。Et菌通过Eha调控这些基因的表达量以抵抗酸性环境的刺激，增加其在细胞内的存活能力。

表2 基于KEGG通路分析在酸性条件eha基因调控差异明显表达的基因

Tab.2 KEGG pathway analysis of theeha-dependent genes differentially expressed in an acid condition

PathwayGeneIDGenedescriptionRNA⁃Seq∗Two⁃componentsystemETATCC＿RS04225hydrogenase2smallsubunit1．229ETATCC＿RS01230multidrugtransporter1．133ETATCC＿RS14195glutaminase1．096ETATCC＿RS081653⁃demethylubiquinone⁃93⁃methyltransferase1．082ETATCC＿RS00005serinedehydratase1．080ETATCC＿RS12655serinedehydratase1．045ETATCC＿RS02740transcriptionalregulator1．025ETATCC＿RS06125[citrate[pro⁃3S]⁃lyase]ligase-3．916ETATCC＿RS06135citratelyasesubunitbeta-3．269ETATCC＿RS06130citratelyasesubunitgamma-3．255ETATCC＿RS07080putativecitratetransporter-2．859ETATCC＿RS06140citratelyasesubunitalpha-2．725ETATCC＿RS061502⁃(5′⁃triphosphoribosyl)⁃3′⁃dephosphoCoAsynthase-2．423ETATCC＿RS06155antiporter-2．372ETATCC＿RS061452⁃(5′⁃triphosphoribosyl)⁃3′⁃dephospho⁃CoAsynthase-2．347ETATCC＿RS16525proteintyrosinephosphatase-2．234ETATCC＿RS16530polysaccharideexportproteinWza-2．202ETATCC＿RS04890aminoacidtransporter-1．216ETATCC＿RS16520tyrosineproteinkinase-1．142ETATCC＿RS11420flagellarproteinFliS-1．115BiosynthesisofsecondarymetabolitesETATCC＿RS10420tryptophansynthasesubunitalpha2．208ETATCC＿RS10415tryptophansynthasesubunitbeta1．787ETATCC＿RS16110inosine⁃5⁃monophosphatedehydrogenase1．400ETATCC＿RS02195phosphoribosylglycinamideformyltransferase1．383ETATCC＿RS06795threoninedehydratase1．341ETATCC＿RS14735chorismatesynthase1．107ETATCC＿RS081653⁃demethylubiquinone⁃93⁃methyltransferase1．082ETATCC＿RS00005serinedehydratase1．080ETATCC＿RS10525glyoxylatereductase1．080ETATCC＿RS12655serinedehydratase1．045ETATCC＿RS12785riboflavinsynthasesubunitalpha1．041ETATCC＿RS02280succinyl⁃diaminopimelatedesuccinylase1．039ETATCC＿RS041802⁃succinyl⁃5⁃enolpyruvyl⁃6⁃hydroxy⁃3⁃cyclohexene⁃1⁃carbox⁃ylatesynthase1．027ETATCC＿RS158158⁃amino⁃7⁃oxononanoatesynthase1．026ETATCC＿RS01185sirohemesynthase1．001ETATCC＿RS07360gluconokinase-3．176ETATCC＿RS10185hypotheticalprotein-1．867ABCtransportersETATCC＿RS16605nickelABCtransporterATP⁃bindingprotein2．617ETATCC＿RS16615nickelABCtransporterpermeaseproteinNikB2．467ETATCC＿RS16600nickelABCtransporterATP⁃bindingproteinNikE2．348ETATCC＿RS16620nickelABCtransportersubstrate⁃bindingprotein2．129ETATCC＿RS16610nickelABCtransporterpermeaseproteinNikC2．055续表PathwayGeneIDGenedescriptionRNA⁃Seq∗

ETATCC＿RS10370aminoacidABCtransportersubstrate⁃bindingprotein1．718ETATCC＿RS11635aminoacidABCtransporterATP⁃bindingprotein1．631ETATCC＿RS10375cysteineABCtransporterpermease1．505ETATCC＿RS07555thiamineABCtransporterpermease1．193ETATCC＿RS14735chorismatesynthase1．107ETATCC＿RS07595ironABCtransporterpermeaseABC1．012ETATCC＿RS04890aminoacidtransporter-1．216FlagellarassemblyETATCC＿RS11420flagellarproteinFliS-1．115ETATCC＿RS14855flagellarhookproteinFlgK-1．072ETATCC＿RS14860flagellarhookproteinFlgL-1．035MicrobialmetabolismindiverseenvironmentsETATCC＿RS10375cysteineABCtransporterpermease1．505ETATCC＿RS13205acidphosphatase1．313ETATCC＿RS04225hydrogenase2smallsubunit1．229ETATCC＿RS10905phosphonoacetaldehydehydrolase1．212ETATCC＿RS06430haloaciddehalogenase1．195ETATCC＿RS14735chorismatesynthase1．107ETATCC＿RS13645cytochromeCnitritereductase1．099ETATCC＿RS10525glyoxylatereductase1．080ETATCC＿RS09485putativeoxidoreductase1．074ETATCC＿RS04220hydrogenase1．048ETATCC＿RS02280succinyl⁃diaminopimelatedesuccinylase1．039ETATCC＿RS087253⁃mercaptopyruvatesulfurtransferase1．036ETATCC＿RS07510putativelong⁃chainfatty⁃acid⁃CoAligase1．014ETATCC＿RS04215putativeNiFe⁃hydrogenase2b⁃typecytochromesubunit1．011ETATCC＿RS01185sirohemesynthase1．001ETATCC＿RS04315thiosulfatesulfurtransferase1．000ETATCC＿RS06135citratelyasesubunitbeta-3．269ETATCC＿RS07360gluconokinase-3．176ETATCC＿RS061502⁃(5′⁃triphosphoribosyl)⁃3′⁃dephosphoCoAsynthase-2．423ETATCC＿RS10185hypotheticalprotein-1．867ETATCC＿RS070755⁃oxopent⁃3⁃ene⁃1，2，5⁃tricarboxylatedecarboxylase-1．156

Note：*RNA-seq，llog2 Ratio (eha_mutant_ET13/wild_ET13)l≥1.00

ABC转运子(ABC transporter)是细菌膜上的一种运输ATP酶，如寡肽透过酶(Oligopeptide permease，Opp)，控制着必需营养物质进出细胞.在本研究中， 12个DEGs涉及该转运路径，编码镍、氨基酸、硫胺素、铁等转运蛋白。金葡菌Opp1ABC转运子运输镍和钴进入细胞,该突变子降低黏附小鼠膀胱和肾脏的能力,以及在泌尿道感染的模型中小鼠死亡率[10]。Et菌通过Eha调控这些基因的表达量以抵抗酸性环境的刺激，增加其在细胞内的存活能力。

微生物次级代谢产物的合成通常以初级代谢产物为前体，并受其调节；次级代谢产物的合成过程易受环境因素的影响. 本研究发现17个DEGs涉及该路径,均呈上调趋势。ETATCC_RS10420和ETATCC_RS10415编码的色氨酸合酶，沙眼衣原体的色氨酸合酶有助于它在Hela细胞内的存活和对干扰素的抵抗力[11]。

本研究发现ETATCC_RS11420、ETATCC_RS14855和ETATCC_RS14860分别编码鞭毛蛋白FliC的分子伴侣FliS、鞭毛钩丝FlgK和FlgL。FlgM-FliA回路在协调细菌鞭毛组装中起关键作用。鞭毛是细菌的运动器官，鞭毛的运动方向受到细菌趋化作用系统的控制，鞭毛对于细菌的环境适应性及致病性至关重要。在假结核耶尔森氏菌中，FliS作为分子伴侣通过调节FlgM的活性,调控后期鞭毛的表达、运动及生物膜形成(biofilm)[12]。生物膜是细菌为适应自然环境，在生长过程中附着于固体表面而形成的特殊存在形式，生物膜的形成显著增强了细菌对环境的抵抗能力。

不同环境中的微生物代谢路径涉及多种物质的代谢与降解过程，参与细菌物质和能量代谢网络。本研究发现20个DEGs直接涉及该路径，ETATCC_RS13205拷贝的酸性磷酸酶，能够在酸性条件下水解磷酸酯键如酪氨酸磷酸酯酶，它可以作用于许多含酪氨酸磷酸的蛋白，这些蛋白涉及信号传导。对于细菌来说，该酶和致病菌的毒力因子I和IV荚膜的合成有关，荚膜直接参与细菌对环境的抵抗能力[13]。

综上所述，我们将RNA-seq技术首次用于Et菌的转录组研究。 Eha通过调控147个靶基因，影响Et的能量,代谢和毒力,以适应其酸性环境。因此，在酸性生存环境，Eha对Et菌的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控,这些结果有助于探讨 Eha调控Et抵抗巨噬细胞酸化的杀菌机制。

[1] Chen AP，Jiang YL，Qian D，et al. Edwardsiellasis[J]. China Fisheries，2011，7: 49-50. (in Chinese)

陈爱平,江育林,钱冬,等. 迟缓爱德华氏菌病 [J].中国水产,2011,7:49-50.

[2] Nelson JJ，Nelson CA，Carter JE. Extraintestinal manifestations ofEdwardsiellatardainfection: a 10-year retrospective review[J]. J La State Med Soc，2009，161 (2): 103-106.

[3] Sheng AK，Li YH，Zhang P，et al.ehagene regulates the virulence ofEdwardsiellatarda[J]. Chin J Zoonoses，2015，31(2): 125-129.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.02.007 (in Chinese)

盛安康,李玉红,张坡,等.eha基因调控迟缓爱德华菌的毒力[J]. 中国人兽共患病学报，2015,31(2):125-129.

[4] Gao D，Cheng J，Zheng E，et al.Eha，a transcriptional regulator of hemolytic activity ofEdwardsiellatarda[J]. FEMS Microbiol Lett，2014，353(2): 132-140. DOI:10.1111/1574-6968. 12420.

[5] Zhang L,Ni C,Xu W,et al. Intramacrophage infection reinforces the virulence ofEdwardsiellatarda[J]. J Bacteriol，2016，198(10): 1534-1542. DOI: 10.1128/JB.00978-15

[6] Xu ZY，Li YH，Cheng J，et al.Ehagene is required forEdwardsiellatardaoxidative stress resistance in macrophage[J]. Chin J Zoonoses，2015，31(6):497-500. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.06.001(in Chinese)

徐泽炎,李玉红,成静,等.eha基因调控迟缓爱德华菌抵抗巨噬细胞氧化杀菌作用[J]. 中国人兽共患病学报，2015,31(6):497-500.

[7] Srinivasa Rao PS，Lim TM，Leung KY. Functional genomics approach to the identification of virulence genes involved inEdwardsiellatardapathogenesis[J]. Infect Immun，2003，71(3): 1343-1351.

[8] Stark RM,Suleiman MS,Hassan IJ，et al. Amino acid utilisation and deamination of glutamine and asparagine byHelicobacterpylori[J]. J Med Microbiol,1997，46(9): 793-800.

[9] Cooper CA,Mainprize IL,Nickerson NN. Genetic，biochemical，and structural analyses of bacterial surface polysaccharides[J]. Adv Exp Med Biol,2015，883: 295-315. DOI: 10.1007 /978-3-319-23603-2_16

[10] Remy L,Carrière M,Derré-Bobillot A，et al. TheStaphylococcusaureusOpp1 ABC transporter imports nickel and cobalt in zinc-depleted conditions and contributes to virulence[J]. Mol Microbiol,2013，87(4): 730-743. DOI: 10.1111/mmi.12126

[11] Muramatsu MK,Brothwell JA,Stein BD，et al. Beyond tryptophan synthase: identification of genes that contribute toChlamydiatrachomatissurvival during Gamma interferon-induced persistence and reactivation[J]. Infect Immun，2016，84(10): 2791-2801. DOI: 10.1128/ IAI.00356-16

[12] Xu S,Peng Z,Cui B,et al. FliS modulates FlgM activity by acting as a non-canonical chaperone to control late flagellar gene expression，motility and biofilm formation in Yersinia pseudotuberculosis[J]. Environ Microbiol，2014，16(4): 1090-1104. DOI: 10.1128 /IAI.00356-16

[13] Caselli A,Paoli P,Santi A,et al. Low molecular weight protein tyrosine phosphatase: Multifaceted functions of an evolutionarily conserved enzyme[J]. Biochim Biophys Acta,2016，1864(10): 1339-1355. DOI: 10.1016/j.bbapap.2016.07.001

Deep sequencing analysis on transcriptomes ofEdwardsiellatardaregulated by Eha following acidification

LIU Nian1，LI Yu-hong1,2，ZHENG En-jin1，GAO Da-qing1，LU Cheng-ping3

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China;2.WuxiMedicineSchool，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China;3.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Our studies tried to demonstrate Eha (Et haemolysin activator) could regulate the resistance of the bacterium against acidification to survive in the macrophage and explain its underlying molecular mechanism. When the bacteria infected the macrophages at time intervals，intracellular survival rate in bafilomycin-treated macrophages was higher than that with untreated cells，and the rate of wild type ET 13 was higher than that of itsehamutant，respectively (P<0.05). The survival rate of the wild type was higher than that of the mutant under acid treatment (P<0.05). To determine the conditions that induced the highest eha expression，we constructed a pMP220-PehaLacZ plasmid and determined thelacZ expression under different conditions. After exposure of pH6.3 medium for 2 h time，we performed the whole transcriptomic profiles of the wild type and mutant by RNA-sequencing. We identified 147 differentially-expressed genes (|log2 ratio|≥1)，113 and 34 of which were significantly up-and down-regulated，respectively in the mutant，comparing with the wild type. These findings were validated by qRT-PCR. GO functional analysis revealed that these genes were divided into 25 categories，including the bacterial catalysis，cellular composition，combination，localization，metabolism，processing，and transportation. Based on the KEGG database，these genes were distributed in 55 pathways，such as two-component system，ABC transporters，and microbial metabolism in diverse environments. Overall，Eha is an important regulator to affect all kinds of target genes and pathways forE.tardato adapt to an acid environment. These results could be helpful for further investigations of the mechanisms by whichE.tardasurvives in macrophages.

ehagene; RNA-sequencing;Edwardsiellatarda; acidification

Gao Da-qing，Email: dgao2@seu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.001

国家自然科学基金(No.31570124)资助

高大庆:Email:dgao2@seu.edu.cn

1.东南大学医学院，南京 210009； 2.江南大学无锡医学院，无锡 214122； 3.南京农业大学动物医学院，南京 21009

R378.2

A

1002-2694(2017)07-0575-08

2016-10-01 编辑：张智芳

Supported by the National Natural Science Foundation (No. 31570124)