8周跑台训练对肥胖小鼠血管内皮细胞胰岛素PI3K/Akt通路的影响

李 娟，沈江振，陈 巍，唐东辉

（1.燕山大学体育学院，河北 秦皇岛 066004；2.河北科技师范学院体育系，河北 秦皇岛 066004；3.北京师范大学体育与运动学院，北京 100875）

8周跑台训练对肥胖小鼠血管内皮细胞胰岛素PI3K/Akt通路的影响

李 娟1，沈江振2，陈 巍2，唐东辉3

（1.燕山大学体育学院，河北 秦皇岛 066004；2.河北科技师范学院体育系，河北 秦皇岛 066004；3.北京师范大学体育与运动学院，北京 100875）

目的：探讨运动锻炼对肥胖小鼠血管内皮细胞胰岛素PIK3/Akt信号通路的影响，揭示运动锻炼降低肥胖者心血管病风险的相关生物学机制。方法：将雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（CG, n=12）与高脂膳食组（HG, n=33），肥胖模型建立后，HG随机分为肥胖组（OG, n=11）与肥胖运动组（OEG, n=13），OEG小鼠接受8周跑台训练（12 m/min，60 min/ time，1 time/ d，6 d/w），记录小鼠体重及能量摄入，免疫组织化学及western blot检测小鼠主动脉内皮IRS1、p-IRS1（Ser307）、Akt及 p-Akt（Thr308）水平的变化。结果：1）OEG小鼠体重较OG下降（P＜0.01）；2）OEG小鼠胰岛素水平及HOMA-IR较OG显著下降（P＜0.05，P＜0.05）；3）OEG小鼠主动脉内皮p-IRS1（Ser307）表达较OG降低（P＜0.05），p-Akt（Thr308）表达较OG显著上升（P＜0.05）。结论：8周跑台训练可降低肥胖小鼠体重增长，改善胰岛素抵抗，促进血管内皮细胞胰岛素PI3K/Akt信号通路转导。

运动；肥胖小鼠；胰岛素抵抗；血管内皮细胞; PI3K/Akt通路

由于人类生活方式发生了变化，导致肥胖（obesity）在全球范围内普遍流行，极大促进了动脉粥样硬化、2型糖尿病、冠心病、高血压等心血管疾病的发病风险[1]。血管内皮功能障碍（endothelial dysfunction）是血管病变的启动环节，几乎与所有的心血管疾病存在密切联系[2-3]。大量研究证实，肥胖诱导的胰岛素抵抗（insulin resistance）在血管内皮功能障碍的发生过程中具有关键性作用[3]。生理条件下，胰岛素可通过作用于血管内皮细胞上胰岛素受体激活经磷酸肌醇3激酶（PIK3）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，增加一氧化氮（NO）释放，促进血管舒张[4]。但在肥胖状态下，多种因素导致血管内皮细胞合成NO的能力下降，血管舒张功能减弱，进而增加上述心血管疾病罹患风险[4-5]。越来越多的研究提示，提高身体活动水平或规律的运动锻炼可以显著降低肥胖者心血管疾病的发病率与死亡率[6-9]，但其中的生物学机制并未完全阐明。在前期研究的基础上，本研究主要探讨8周跑台训练对肥胖小鼠血管内皮细胞胰岛素信号调节蛋白表达及其磷酸化水平的影响，揭示运动锻炼改善肥胖相关血管内皮功能障碍、降低心血管病风险的生物学机制。

1 实验对象与方法

1.1 实验对象与分组 雄性C57BL/6小鼠（6 weeks，15.62±1.45g，n=45），由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，小鼠在实验室内分笼饲养，自由进食饮水，明暗交替周期为12h，动物房温度为25℃±2℃，相对湿度为45%±10%。小鼠在动物房内适应性饲养3天后随机分为2组：对照组（CG,n=12）、高脂膳食组（HG，n=33），12周后将肥胖建模成功的小鼠（n=24）再随机分为肥胖组（OG，n=11）、肥胖运动组（OEG，n=13）。

1.2 肥胖小鼠模型的建立 适应性饲养结束后，CG小鼠进食普通饲料（2.90kcal/g,13%脂肪，64%糖，23%蛋白质）；OG与OEG小鼠进食高脂饲料（4.20kcal/g，51%脂肪，33%糖，16%蛋白质）。喂养12周后，将小鼠体重超过CG小鼠平均体重20%作为肥胖模型成功标准。剔除体重未达标的小鼠，然后，OG与OEG小鼠继续采用高脂饲料喂养，OEG开始进行为期8周的跑台运动干预，CG与OG小鼠不进行运动干预。

1.3 运动干预方案 运动干预采用电动跑台训练（成都泰盟，FT-200），跑台坡度为0度，恒定跑速为12m/ min，每次训练时间为60min，每日训练1次，每周连续训练6天，连续进行6周。

1.4 能量摄入及体重的计算 实验期间,每日详细记录小鼠进食行为与摄食量，每周计算1次24h平均能量摄入量及食物消耗量。小鼠24h能量摄入量（kcal/24h）= 食物消耗量（g/24h）×食物的能量密度（kcal/g）。每24h称量一次小鼠体重（0.1g）。

1.5 样品采集及处理 最后一次运动结束48h后，每组取6只小鼠，用5%的水合氯醛溶液对小鼠腹腔注射（0.5 ml/10g），深度麻醉后，眼球取血，将全血放入离心管，以3500rp/min离心10min后，分离血清，分装后置4℃环境待测；打开胸腔，分离主动脉，取结缔组织，生理盐水洗净，取适当长度置4%多聚甲醛溶液中固定，剩余血管组织用液氮冷冻后低温保存。

1.6 血清生化指标检测 小鼠血糖水平采用血糖仪（OMRON,中国）检测；胰岛素水平采用ELISA法测定，操作步骤严格按照试剂盒（美国R&D公司）说明书进行。稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），HOMAIR=空腹胰岛素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）/ 22.5。

1.7 免疫组织化学 将甲醛固定后的小鼠主动脉进行石蜡包埋，休块后，以5μm的厚度切片，将其附贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，37℃过夜，脱蜡，蒸馏水洗3次，5%BSA封闭30min，滴加一抗孵育，4℃过夜。PBS冲洗10min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃静置30min。PBS冲洗2min×3次；滴加试剂SABC，37℃静置30min，PBS冲洗5min×3次，经DAB显色后采用苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，采用Image-Pro Plus6.0软件统计每个高倍视野内的阳性细胞的平均光密度值（average optical density, AOD）。

1.8 Western blot检测 小鼠血管内皮组织蛋白表达采用Western blot法，将适量血管组织进行剪切后放置预冷的匀浆器充分研磨后，加入适量裂解液裂解30min，以12 000r/min离心10min取上清液分装，BCA法测定蛋白浓度。依次上样、电泳、转膜、封闭，加入稀释的单克隆抗体，孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育60min，将ECL工作液加置PVDF膜，室温下孵育5min后用保鲜膜包好PVDF膜，经显影、曝光、洗膜、封闭。将β-actin单克隆抗体按1∶500稀释到一抗稀释液中，室温下摇动60min，按上述方法得到内参条带，将胶片用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1.9 统计学处理 本实验所得的数据采用SPSS18.0软件进行统计学分析，所有的计量资料以均数±标准差（±s）表示。各变量组间均数的比较采用方差分析（one way ANOVA），显著性水平均为P＜0.05。

2 结 果

2.1 小鼠体重变化 从第6周开始HG小鼠体重显著高于CG小鼠（P＜0.01）。第12周开始进行运动干预，将HG中符合肥胖标准的小鼠随机分为OG与OEG，与OG比较，OEG小鼠从第15周开始体重显著下降（P＜0.01）（图1A）。

图1 小鼠体重与能量摄入变化

2.2 小鼠能量摄入变化 HG小鼠在整个饲养过程中每日能量摄入显著高于CG（P＜0.01）；运动干预开始后，OEG小鼠每日能量摄入在第13周、第14周均显著高于OG（P＜0.01），从第15周至第20周每日能量摄入，两组未见显著差异（图1B）。

2.3 小鼠血糖、胰岛素及HOMA-IR的比较 与CG比较，OG小鼠血糖水平未见显著变化，但胰岛素水平及HOMA-IR却显著升高（P＜0.01，P＜0.05）；与OG比较，OEG小鼠胰岛素水平及HOMA-IR均显著下降（P＜0.05，P＜0.05）（图2）。

图2 小鼠血糖、胰岛素及HOMA-IR的比较

2.4 小鼠血管内皮细胞的IRS1与Akt表达及磷酸化水平比较 免疫组织化学结果显示，位于血管内皮细胞层的目标蛋白的免疫阳性反应呈棕黄色染色（图3）。与CG比较，OG小鼠血管内皮IRS1及Akt的蛋白表达未发生显著变化，但p-IRS1的表达水平非常显著升高（P＜0.01），而p-Akt的表达非常显著降低（P＜0.01）；与OG比较，OEG小鼠血管内皮p-IRS1显著降低（P＜0.05），p-Akt表达显著增高（P＜0.05）（图4）。

图3 小鼠血管内皮细胞p-IRS-1及p-Akt的定位表达

图4 小鼠血管内皮细胞IRS1、Akt的蛋白表达及磷酸化水平比较

3 讨 论

伴随着经济社会的快速发展，肥胖在发达与发展中国家已成为影响人类健康的社会问题，也成为决定疾病模式变化的重要因素[1]。其中，胰岛素抵抗是指胰岛素靶组织对正常剂量的胰岛素敏感性下降，即生理剂量的胰岛素不能够维持其正常的生理功能，胰岛素抵抗是联系肥胖与多种代谢异常的重要纽带。除了经典的靶组织，如骨骼肌、脂肪及肝脏组织外，胰岛素还可以通过作用于血管内皮细胞的特异性受体，激活胰岛素受体底物（IRS），通过PI3K或者丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径调节血管内皮源性舒张因子与收缩因子的释放，调控血管平滑肌舒张与收缩[4-5]。肥胖诱导的胰岛素抵抗可通过引起血管内皮功能障碍，增加心血管病风险[5]。充分的证据表明，规律的运动锻炼对降低肥胖者代谢性疾病风险具有重要的意义[6-8]。但相关生物学机制并未完全阐明。

本研究发现，肥胖小鼠的胰岛素抵抗指数较正常小鼠明显增加，血管内皮p-IRS1（Ser307）水平明显增加，而p-Akt（Thr308）水平却显著下降，这提示肥胖小鼠血管内皮细胞胰岛素PI3K/Akt信号途径存在障碍。研究表明，胰岛素作用于内皮细胞受体后，可通过IR/IRS/ PI3K/Akt信号通路增加一氧化氮合酶（eNOS）的活性，促进内皮细胞合成NO[9-11]。另一方面，胰岛素还可作用于血管内皮细胞的MAPK通路促进内皮素（ET-1）的释放，NO与ET-1是体内最重要的舒血管物质和缩血管物质，这两种物质保持平衡是维持血管张力正常的重要基础[11]。对于IRS1而言，胰岛素信号转导发生障碍后，其酪氨酸磷酸化水平会下降，而丝氨酸磷酸化水平会增加，进而导致PI3K依赖的胰岛素信号通路抑制，NO合成降低，但是血管内皮细胞MAPK信号依然正常，这就造成血管内皮细胞ET-1的分泌量相对增加，最终导致血管趋向于收缩[5,12]。血管持续收缩会产生许多不良结果，一方面会使动脉血压增加；另一方面会导致胰岛素的靶组织血流灌注量降低，增加胰岛素抵抗的程度[3,13]。肥胖者血管内皮功能障碍主要的原因就是血管内皮细胞NO合成减少所致[3,6]。这可能是胰岛素抵抗增加肥胖人群心血管疾病风险的重要原因之一。本研究还发现，经过8周跑台训练后，肥胖小鼠体重增长速度与胰岛素抵抗指数均显著降低。同时还发现，8周跑台训练显著降低了肥胖小鼠血管内皮细胞p-IRS1（Ser307）水平，而p-Akt（Thr308）水平却显著升高。这提示运动干预可促进肥胖小鼠血管内皮细胞胰岛素PI3K/Akt信号转导，改善胰岛素抵抗。

目前，运动锻炼改善肥胖相关胰岛素抵抗的机制已经成为研究热点。本研究结果提示，运动干预可显著改善肥胖小鼠胰岛素抵抗，提高血管内皮细胞胰岛素信号转导，这二者之间可能存在密切联系。由于胰岛素抵抗被认为是孕育多种代谢性疾病的“共同土壤”，因此，肥胖者应重视通过规律的运动锻炼改善胰岛素抵抗与血管内皮功能，这可能会成为肥胖者降低心血管疾病风险的重要策略。

4 结 论

8周跑台训练可以明显降低肥胖小鼠体重增长，改善胰岛素抵抗，同时还可以促进血管内皮细胞胰岛素PI3K/ Akt信号转导。这可能是规律运动锻炼降低肥胖者心血管疾病风险的重要生物学机制之一。

[1]Finkelstein EA, Khavjou OA, Thompson H, et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030 [J].Am J Prev Med, 2012, 42(6): 563-570.

[2]Brian E. Sansbury, Bradford G. Hill. Regulation of obesity and insulin resistance by nitric oxide [J]. Free Radical Biology and Medicine, 2014,73: 383-399.

[3]Angelo Avogaro, Saula Vigili de Kreutzenberg. Mechanisms of endothelial dysfunction in obesity [J].Clinica Chimica Acta, 2005, 360(1-2): 9-26.

[4]唐东辉,李娟.肥胖儿童血管内皮细胞胰岛素抵抗及运动干预的研究现状[J].沈阳体育学院学报,2014, 33(1):82-86.

[5]Matthias Barton, Renata Carmona, Jana Ortmann, et al.Obesity-associated activation of angiotensin and endothelin in the cardiovascular system [J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2003,35: 826-837.

[6]李娟,唐东辉,陈巍.有氧运动结合抗阻训练对男性肥胖青少年心血管功能的改善及可能机制[J].体育科学, 2013, 33(8): 37-42.

[7]Aaron S Kelly, Rachel J Wetzsteon, Daniel R Kaiser, et al. Inflammation, insulin, and endothelial function in overweight children and adolescents: The role of exercise [J].The Journal of Pediatrics, 2004, 145(6): 731-736.

[8]Satoshi Kurose, Hiromi Tsutsumi, Yutaka Yamanaka, et al. Improvement in endothelial function by lifestyle modification focused on exercise training is associated with insulin resistance in obese patients [J].Obesity Research & Clinical Practice, 2014, 8(1):106-114.

[9]唐东辉,刘润芝,李娟,等.8周游泳运动干预对肥胖小鼠血管内皮功能改善及其炎症机制[J].中国体育科技,2016, 52(6): 86-91.

[10]李娟, 陈巍, 唐东辉. 肥胖激活血管ET-1系统与胰岛素抵抗及运动干预的研究进展[J].中国康复医学杂志, 2015, 30(10): 1074-1077.

[11]Carmine Cardillo, Francesca Schinz ari, Angelo Adamo, et al. Endothelin-dependentvasoconstrictor activity in metabolically healthy and unhealthy obese patients [J].Life Sciences, 2013, 93(25-26):75.

[12]丁丽, 张锦.胰岛素对血管内皮细胞的作用[J].国际内分泌代谢，2010, 30(5): 337-339.

[13]Ranganath Muniyappa, Sahzene Yavuz. Metabolic actions of angiotensin II and insulin: A microvascular endothelial balancing act[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2013, 378:59-69.

Effects of 8-week Treadmill Training on PI3K/Akt Pathway in Vascular Endothelial Cells of Obese Mice

LI Juan1, SHEN Jiang-zhen2, CHEN Wei2, TANG Dong-hui3
(1. College of Physical Education，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei China；2. Department of Physical Education, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei China；3. P.E. and Sport College, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)

The objective of this study is to investigate the effect of treadmill exercise on PI3K/Akt pathway of vascular endothelial cells in obese mice. Methods: male C57BL/6 mice were randomly divided into control group (CG, n=12) and high fat group (HG, n=33). HG were randomly divided into obesity group (OG, n=11) and obesity group (OEG, n=13) after obese model induced by high fat diet, OEG mice were taken treadmill exercise for 8 weeks (12 m/min, 60 min/ time, 1 time/d, 6 d/w); the body weight and energy intake were recorded, the IRS1, p-IRS1(Ser307), Akt and p-Akt (Thr308) in aortic endothelium were detected by immunohistochemistry and western blot. Results: 1) the body weight of OEG mice was lower than CG (P < 0.01). 2) The insulin level and HOMA-IR signif i cantly increased in OG (P < 0.01, P < 0.01); and insulin levels and HOMA-IR signif i cantly decreased in OEG compared with OG (P < 0.05, P < 0.01). 3) The expression of TH in VTA-NAc system was lower in OG than CG (P < 0.01); and was morein OEG than OG (P < 0.05). The expression p-IRS1(Ser307) in OEG was lower than OG (P < 0.05), and the p-Akt (Thr308) expression was more in OEG than OG (P < 0.05). Conclusion: 8-week treadmill training can decrease weight gain, improve insulin resistance, and promote insulin PI3K/Akt signaling pathway in vascular endothelial cells in obese mice.

exercise; obese mice; insulin resistance; endothelial cell; PI3K/Akt signaling

G804.2

A

1004 - 7662(2017)04- 0084- 05

2017-03-03

国家自然科学基金（项目编号：81472992）；燕山大学青年教师自主研究计划课题资助（项目编号：14LGB030）。

李娟，讲师，硕士，研究方向：运动防治肥胖生物学机制。