鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

梁 惠 （山东省蓬莱市大辛店畜牧工作站 265612）

鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

梁 惠 （山东省蓬莱市大辛店畜牧工作站 265612）

采集烟台地区某鸭场鸭传染性浆膜炎疑似病料进行细菌分离，并对分离细菌进行生化鉴定、PCR鉴定、动物试验和药敏试验。结果表明：分离得到的2株细菌均为鸭疫里默氏杆菌，分离株对头孢氨苄、头孢噻肟高度敏感，对氨苄西林、多粘菌素B、丁胺卡那、氟苯尼考、庆大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、链霉素、恩诺沙星中度敏感，对环丙沙星、氟哌酸、复方新诺明、磺胺嘧啶、利福平、四环素不敏感。说明头孢氨苄、头孢噻肟可作为此养鸭场防治该病的首选药物，其他药物须减少或暂停使用。

鸭疫里默氏杆菌 分离 鉴定 药敏试验

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)简称鸭疫里氏杆菌，由其引起的疾病称为鸭传染性浆膜炎，是鸭、鹅等多种禽类的一种急性或慢性传染病[1]，主要危害1-8周龄的小鸭，在临床上表现为困倦、眼鼻有分泌物，绿色下痢，共济失调和抽搐，慢性病例可出现头颈歪斜；病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎，是危害养鸭业最主要的传染病之一，如果治疗不及时可引起大批死亡，给养鸭业带来巨大的经济损失。

在养鸭的过程中，为了防治细菌性传染病的发生，盲目使用一些抗菌药物，导致环境中RA的耐药性菌株越来越多，表现为多重耐药和交叉耐药[2]，并且不同地区不同养殖场RA的耐药性不同，这给本病的防治带来很大的困难，此外，RA血清型多，有20多个，流行于我国的血清型主要有1、2、3、4、5、7、8、10、11、13、14和其他未知血清型[3]，血清型之间无交叉免疫作用，因血清型不符而导致疫苗免疫失败，因此有必要进行RA的分离鉴定，为鸭传染性浆膜炎的防治提供一定的指导，并为研究符合当地血清型的疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 烟台地区发病鸭场，无菌采集疑似鸭传染性浆膜炎病死鸭的心脏、肝脏、脑组织。

1.1.2 培养基、试剂 普通营养琼脂、麦康凯培养基、TSA、TSB均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；生化试剂和药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；高保真Taq DNA聚合酶购自北京赛百盛基因技术有限公司，细菌DNAout(G+)购自绵阳高新区天泽基因工程有限公司。

1.1.3 试验动物 10日龄RA未免疫健康雏鸭15只来自烟台蓬莱某养鸭场，常规饲养3d，未发现任何异常，供动物试验用。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 将采集的病料分别划线接种于麦康凯培养基、普通营养琼脂、TSA，并将TSA置CO2培养箱，普通营养琼脂和麦康凯培养基置普通培养箱，37℃恒温培养24h，选择符合RA特性的菌落，然后涂片、革兰氏染色、镜检，观察结果。并挑取单个菌落反复划线观察，进行分离菌的纯培养。

1.2.2 生化鉴定 根据《伯杰细菌鉴定手册》[4]对分离细菌进行常规的生理生化鉴定。

1.2.3 PCR鉴定 （1）引物的设计与合成：根据GenBank中已发表的RA16S rRNA基因序列，应用Primer5.0软件自行设计合成了一对能扩增1115bp基因片段的引物，序列如下：P1: 5’GTA TTC ACC GCG CCA TGG CT3’；P2: 5’ TTG GTG AGG TAA CGG CTC AC3’.送北京赛百盛基因技术有限公司合成。（2）RA基因组DNA的提取：挑取RA单菌落，接种到5ml TSB中，37oC振荡培养过夜，参考细菌DNAout(G+)试剂盒说明书提取全基因组。（3）PCR体系与反应条件：以提取的RA全基因组为模板，用合成的引物进行PCR扩增，反应条件为：94oC预变性5min；94oC 1min，51oC 1min，72oC 1min，30个循环；72oC 10min。PCR结束后，取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。

1.2.4 动物试验 将2株分离菌株分别接种于TSA上，置CO2培养箱37℃培养48h，将平板上所有菌落刮下，混于灭菌生理盐水中制成细菌悬液，并调整细菌浓度为107CFU/ml。选取15只饲养至13日龄的健康肉鸭，随机分为3组，每组5只，试验组每只腿部皮下接种菌液0.5ml，对照组用灭菌生理盐水注射。接种后每日观察记录鸭的精神、食欲、饮水、粪便、运动及死亡情况，并对死亡鸭进行病理剖检，并取死亡鸭的心血、肝组织进行细菌分离培养。

1.2.5 药敏试验 参照《兽医微生物学实验指导》圆纸片扩散法[5]，将2株分离株的菌落分别用灭菌生理盐水洗脱，分别均匀涂布在TSA上，然后将庆大霉素、卡那霉素等16种常用抗菌药物的药敏试纸分别贴到平板表面，二氧化碳培养箱37℃培养24h，观察抑菌圈的大小并记录结果。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

经鉴别培养和涂片、染色、镜检，从采集的病料中分离得到2株疑似RA。细菌在TSA上生长良好，形成光滑、中央隆起、奶油状的圆形菌落，在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不生长。显微镜下观察呈革兰氏阴性、瑞氏染色两极浓染的短杆菌。

2.2 生化鉴定

2株分离株生化鉴定结果一致，均符合RA的生化特性，结果见表1

表1 生化鉴定结果

2.3 PCR鉴定

以提取的细菌DNA基因组为模板，应用合成的P1和P2为引物进行PCR反应扩增目的基因，所获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳呈单一条带，大小与预期1115bp相符(见附图)

附图 PCR扩增结果M：DNA标准DL2000；1：分离株1扩增产物；2：分离株2扩增产物

2.4 动物试验结果

2组试验组的5只小鸭在接种细菌2d后，表现为精神沉郁、采食量下降、眼鼻有分泌物、排黄绿色稀粪，死亡之前有头颈震颤、抽搐、共济失调、角弓反张等明显神经症状，分别于接种后3~4d出现死亡，对照组的5只小鸭精神、食欲无异常。病死鸭剖检可见典型的纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎，取脑，心血和肝组织进行细菌分离，其培养特性、生化特性与RA一致。

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果见表2。结果表明，分离株对头孢氨苄、头孢噻肟高度敏感，对氨苄西林、多粘菌素B、丁胺卡那、氟苯尼考、庆大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、链霉素中度敏感，对环丙沙星、氟哌酸、复方新诺明、磺胺嘧啶、利福平、四环素不敏感。

表2 分离株药敏试验结果

3 讨论

（1）诊断鸭传染性浆膜炎时应与鸭大肠杆菌病相区别，两者在临床症状和剖检病变上极为相似，但在细菌的培养特性和生化特性上大不相同。本试验从临床疑似病例中分离得到一株细菌，通过培养特性、形态观察、生化试验进行鉴定，由于RA生化特性存在一定的差异[6]，生化鉴定结果只能初步鉴定分离株为RA，因此通过PCR进一步鉴定分离菌株为RA，RA菌株的获得为进一步研究该病有效的防制方法奠定了基础。（2）临床上抗菌药物的滥用，导致RA的耐药性在不断地增加，给该病的防治带来了巨大的困难，鸭传染性浆膜炎的防治须在药敏试验的基础上进行。本试验的药敏试验结果表明，分离菌株对头孢氨苄、头孢噻肟高度敏感，可作为此养鸭场防治该病的首选药物，其他药物须减少或暂停使用。（3）疫苗免疫是预防鸭传染性浆膜炎的有效措施之一，由于RA血清型多，不同血清型间缺乏交叉免疫力，并且该病可出现多种血清型混合感染及新的血清型不断出现[7]，因此，疫苗免疫效果差。在应用疫苗免疫时，应经常对本地区本养殖场的流行菌株进行鉴定，选择同血清型的疫苗或自家苗进行免疫接种，确保免疫效果。

[1] 陈溥言. 兽医传染病学(第5版)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2006: 400-401.

[2] 陆新浩, 陈秋英, 诸明涛等. 鸭疫里默氏杆菌病病原分离及耐药性调查[J]. 中国家禽, 2010, 32(17): 50-51.

[3] 程安春, 汪铭书, 陈孝跃等. 我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性[J]. 中国兽医学报, 2003, 23(4): 320-323.

[4] R.E. 布坎南, N.E. 吉本斯. 伯杰细菌鉴定手册(中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译)[M]. 北京: 科学出版社, 1984: 385-388.

[5] 姚火春. 兽医微生物学实验指导(第2版)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002: 43-44.

[6] 蔡家利, 魏光河, 夏春玲等. 鸭疫里默氏杆菌培养特性的研究[J].中国家禽, 2004, 8(1): 82-85.

[7] 傅心亮, 嵇辛勤, 文明等. 贵州鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 40(8): 155-158.

S852.61+2

A

1007-1733(2017)07-0011-02

2017–03–14）