气相色谱-质谱用于2型糖尿病患者血清代谢特征研究

谷 艳，臧 鹏，李 吉，吕海珍

（1.山西大同大学医学院，山西大同037009；2.大同市第三人民医院，山西大同037009）

气相色谱-质谱用于2型糖尿病患者血清代谢特征研究

谷 艳1，臧 鹏2，李 吉1，吕海珍1

（1.山西大同大学医学院，山西大同037009；2.大同市第三人民医院，山西大同037009）

目的研究2型糖尿病患者的血清代谢特征。方法采用气相色谱-质谱（GC/MS）联用技术对健康人及2型糖尿病患者的血清代谢物谱进行分析测定。对采集的图谱进行峰提取、峰匹配和过滤后，采用SIMCA-P 11.0软件及SPSS13.0软件进行数据分析。结果2型糖尿病患者与健康人的血清代谢物谱之间存在明显差异,偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）得分散点图中疾病组与健康对照组得到了良好区分；单元统计分析发现，在2型糖尿病组与健康对照组间共有22个变量存在着显著性差异，主要涉及糖代谢、脂代谢及氨基酸代谢。在糖类代谢物中，葡萄糖、半乳糖含量在糖尿病患者血清中明显高于正常对照组；在脂类代谢物中，甘油和游离脂肪酸（FFA C16：0、FFA C18：1、FFA C18：2）含量高于正常对照组；氨基酸类代谢物中，缬氨酸及其代谢物2-酮戊二酸、亮氨酸、异亮氨酸以及代谢物2-酮异己酸的浓度较正常组显著升高，而甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺的浓度显著降低。结论2型糖尿病患者的血清代谢谱发生了明显改变，差异代谢物的紊乱反映了糖尿病状态下糖、脂、氨基酸代谢途径的改变，这些代谢物在2型糖尿病的发病过程中可能具有重要的病理意义，同时也为临床诊断提供了依据。

2型糖尿病；气相色谱；质谱；代谢组学

糖尿病是一组由遗传和环境等多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，主要有1型糖尿病、2型糖尿病、其他特殊类型糖尿病及妊娠型糖尿病4种类型。其中，2型糖尿病占糖尿病患者总数的90%以上。目前，我国的糖尿病发病率进入快速增长阶段[1]，长期高血糖可导致全身组织器官出现严重并发症，极大地影响患者的生活质量。因此，对于2型糖尿病的发病机制及其药物治疗一直是医学界研究的重点[2-7]。本研究利用GC/MS技术对2型糖尿病患者血清样本进行代谢指纹分析，采用多元统计分析对样本进行模式识别，分析健康对照组及2型糖尿病组的血清代谢谱差异；找到影响2型糖尿病患者体内代谢改变的差异代谢物及其相关代谢途径，为今后深入研究2型糖尿病的发生发展过程及病理机制奠定基础。

1 实验部分

1.1 研究对象与材料仪器

研究对象：初诊2型糖尿病病人36例，正常人40例血清样本来自大同市第三人民医院。根据世界卫生组织对糖尿病的诊断标准,2型糖尿病空腹血糖≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L,而正常糖耐量为空腹血糖＜5.6 mmol/L。

甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲氧胺盐酸盐、吡啶、N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）（美国Sigma公司）。

Agilent 7890A气相色谱仪（美国Agilent公司）；Agilent 5975C质谱仪（美国Agilent公司）；Biofuge Stratos低温高速离心机（德国Thermo公司）；Labconco 4.5 L台式真空冷冻干燥机（美国Labconco公司）。

1.2 GC/MS实验

1.2.1 血清样品处理

血清样品于4°C下解冻。取100 μL血清，加入300 μL甲醇，涡旋混合30 s，15 000 r/min离心 20 min。取上清液350 μL，10 °C下真空冷冻干燥。残渣加65 μL甲氧胺盐酸盐吡啶溶液（20 mg/mL），40°C水浴反应1.5 h，再加入65 μL MSTFA，混匀后40°C水浴反应1 h。反应后的溶液直接进行GC/MS分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：HP-5熔融石英毛细管柱（30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm，J＆W Scientific,美国），氦气作载气,流速为1.0 mL/min，进样口温度为300°C，分流比为10∶1，进样量为1 μL。程序升温：起始温度为60 °C，保持3 min，以3°C/min的速度升至200 °C，最后以15°C/min的速度升至320°C，保持5 min。

1.2.3 质谱条件

用电子轰击离子源（EI），传输线温度280°，离子源温度230°，检测器电压1.46 kV，四级杆温度150°，扫描范围33～500 amu。

1.2.4 数据分析

采用XCMS软件进行色谱峰的匹配和识别，得到由保留时间、质荷比以及峰面积构成的峰表。采用80%规则对峰表进行信号过滤，经过预处理后的数据导入SIMCA-P 11.0软件进行模式识别。单变量分析使用SPSS 13.0软件进行，P＜0.05认为具有统计学差异。

1.2.5 差异代谢物鉴定

将实验得到的差异代谢物的质谱图与NIST标准图谱库进行比对，定性过程由仪器工作站完成。相似度大于75%的代谢物被认为定性结果可靠。

2 结果与讨论

2.1 2型糖尿病组及健康对照组血清GC/MS分析的总离子流色谱图

对血清样本进行代谢特征分析时，每隔10个样本随行制备分析1个QC样品（QC是将所有血清样品，取等体积混合后得到的溶液），通过检测QC样本的偏差来检测整个分析过程的稳定性。结果表明，保留时间及峰面积的相对标准偏差均低于20%，表明在样品分析的整个过程中系统的稳定性良好，所得数据可信。

采用GC/MS平台分别采集健康对照组和2型糖尿病组的血清代谢物谱信息，血清样品的典型总离子流色谱图见图1。

图1 血清样品的典型GC/MS总离子流色谱图

2.2 多元统计分析

多元统计分析是在最大程度保留原始信息的基础上将多维数据进行简化和降维，通过建立可靠的数学模型对数据进行概括与图示化表征[8]。本实验利用多元统计分析中的偏最小二乘法-判别分析（PLD-SA）进行多变量模式识别，通过去除与样本分类无关的信息，从而对2组样品的代谢物谱进行区分。由PLS-DA得分图（图2）可知，2型糖尿病组与正常对照组在第一主成分方向上得到了显著的区分，模型参数R2Y=0.76，Q2=0.69，证实了模型的可靠性。实验结果表明，2型糖尿病组与正常对照组的血清代谢物谱存在着差异，患者的代谢物水平发生了变化。

2.3 单变量分析

将2组获得的代谢物数据进行Student t检验，在正常组与2型糖尿病组间共有22个变量存在着显著性差异，经谱库检索，共有19个变量被鉴定（表1）。由表1可知，2型糖尿病患者体内的糖、脂、氨基酸代谢均发生了紊乱，表现为在糖类代谢物中，葡萄糖、半乳糖的含量显著高于正常对照组；在脂代谢中，甘油和游离脂肪酸（FFA C16：0、FFA C18：1、FFA C18：2）的含量明显高于正常对照组；在氨基酸代谢中，缬氨酸及其代谢物2-酮戊二酸、亮氨酸、异亮氨酸以及代谢物2-酮异己酸的浓度较正常组显著升高，而甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺的浓度较正常组显著降低。这些代谢物的改变说明2型糖尿病患者在糖、脂和氨基酸代谢途径上存在着显著的代谢紊乱，因此，三羧酸循环这一代谢中心的的动态平衡也被打破，表现为2-酮戊二酸的浓度异常增高。

图2 基于2型糖尿病与健康人血清代谢谱的PLS-DA得分图

表1 2型糖尿病患者血清中的差异代谢物

3 结论

本研究采用基于GC/MS平台的代谢组学技术结合统计分析，探讨了2型糖尿病患者血清的代谢指纹图谱变化情况。结果表明，2型糖尿病患者的血清代谢谱与正常对照组相比发生了显著变化，多种代谢物水平发生了明显改变。本文以代谢组学平台研究了2型糖尿病的代谢状况，发现了多种紊乱的代谢途径，从而可为深入研究2型糖尿病的发病原因提供参考，也为疾病研究提供了一种新的有效平台。

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[8]Lindon J C,Nicholson J K,Holmes E.代谢组学手册[M].北京：科学出版社,2008.

Serum Metabonomics Study on Type 2 Diabetes by Using Gas Chromatography/Mass Spectrometry

GU Yan1，ZANG Peng2，LI Ji1，LU Hai-zhen1
(1.School of Medicine,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009；2.Datong Third People’s Hospital,Datong Shanxi,037009)

ObjectiveTo investigate the serum metabolic characteristics of type 2 diabetes patients.MethodsThe serum metabolic profiles of healthy controls and type 2 diabetes patients were determined by using gas chromatography coupled with mass spectrometry(GC/MS).Firstly,obtained raw chromatograms were processed by peak extraction,peak match and filtration.Secondly,the data were analyzed through the SIMCA-P 11.0 software and SPSS13.0 software.ResultsThere were obvious metabolic differences between type 2 diabetes and healthy controls.The scores plot by PLS-DA showed that the type 2 diabetes group was distinctly differentiated with the healthy controls.By using univariate data analysis,22 variables had significant differences between the two groups,and these metabolites variations are related to the dysfunctions in glucose metabolism,lipid metabolism and amino acid metabolism.Compared with the healthy controls,the type 2 diabetes group showed elevated serum concentrations of valine,2-ketoisovalerate,2-ketoisocaproate,leucine,isoleucine,2-hydroxybutyrate,2-ketoglutarate,galactose,glucose,FFA C16：0,FFA C18：2,FFA C18：1 and glycerol,but decreased levels of glycine,tryptophan,serine,threonine,phenylalanine and asparagine.ConclusionsThe results revealed that type 2 diabetes patients presented perturbations in glucose metabolism,lipid metabolism and amino acid metabolism.This study was helpful for revealing the complex pathological mechanism in type 2 diabetes and providing a basis for clinical diagnosis.

type 2 diabetes；gas chromatography；mass spectrometry；metabonomics

R587.1

A

1674-0874(2017)02-0033-03

〔责任编辑 杨德兵〕

2017-02-23

山西大同大学博士基金项目[2013-25]

谷艳（1981-），女，山西大同人，博士，讲师，研究方向：代谢组学技术用于疾病治疗药性的机理研究。