羊肚菌等9种食用菌抗氧化活性研究

赵 英，刘晓慧，刘小翠，卢永昌∗

（1.青海民族大学药学院，青海西宁810007；2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海西宁810007；3.青海民族大学化学化工学院，青海西宁810007）

羊肚菌等9种食用菌抗氧化活性研究

赵 英1，2，刘晓慧3，刘小翠1，2，卢永昌1,2∗

（1.青海民族大学药学院，青海西宁810007；2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海西宁810007；3.青海民族大学化学化工学院，青海西宁810007）

通过对DPPH自由基清除能力、还原能力和清除羟基自由基能力的研究，比较羊肚菌、圆孢蘑菇、杏鲍菇、香菇、圆菇、白玉菇、平菇、金针菇和姬菇的甲醇提取物的抗氧化能力。结果显示：9种食用菌甲醇提取物具有不同程度的抗氧化活性，其中圆孢蘑菇甲醇提取物对DPPH自由基清除能力最强，其EC50值为346.50 μg/mL，羊肚菌甲醇提取物的铁氰化钾还原力最强，平菇甲醇提取物的羟基自由基清除能力最强，其EC50为 863.74 μg/mL。

羊肚菌；圆孢蘑菇；平菇；抗氧化活性

近代医学指出，体内自由基反应与一些疾病的发生、发展和老化进程密切相关。活性氧能对许多生物大分子，比如对DNA、蛋白质产生破坏，造成其相关结构和细胞功能的损伤[1]。到目前为止，医学界已发现近百种疾病都与自由基有关，尤其是退化性疾病，如动脉粥样硬化、肿瘤、白内障、衰老、关节炎和肝病等[2]。而抗氧化剂能捕获并中和自由基，从而去除自由基对人体的损害。为此，人们越来越注重发现和研究天然抗氧化剂。食用菌不仅具有人体需要的各种营养物质，还含有很多活性成分，这些活性成分在抗氧化、抗癌、抗肿瘤、降血脂血糖等方面具有良好的作用[3]。本文选用市面上常见食用菌及部分珍稀食用菌，包括：羊肚菌（Morehella esculenta(L.)Per），圆孢蘑菇（Agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton），杏鲍菇（Pleurotus eryngii Quel.），香菇（Lentinus edodes(Berk.)sing），圆菇（Mushroom），白玉菇（Pleurotus nebrodensis），平菇（Pleurotus ostreatus），金针菇（F.velutipes and Pleurotus ostreatus），姬菇（Pleurotus ostreatus）进行试验分析，采用DPPH自由基清除能力、铁氰化钾还原能力及羟基自由基清除能力测定评价9种食用菌甲醇提取物的抗氧化能力，旨在为日常生活品质的提高及食用菌的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料

羊肚菌和圆孢蘑菇由青海民族大学卢永昌教授采集提供。白玉菇、香菇、圆菇、平菇、姬菇、金针菇和杏鲍菇均购买于青海省西宁市华联超市。

1.2 试验试剂

1，1二苯基-2-苦肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical，DPPH，纯度＞97%）购自日本东京化成工业株式会社；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、盐酸购自天津市大茂化学剂厂,均为分析纯；TRIS购自北京索莱宝科技有限公司；邻二氮菲购自天津科密欧化学试剂有限公司；抗坏血酸购自上海谱振生物有限公司；无水甲醇；蒸馏水。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计，T6新悦，北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发仪，R-215，瑞士步琪；离心机，TD3，长沙湘仪离心机仪器有限公司；数显恒温水浴锅，HH-6，金坛市杰瑞尔电器有限公司；数控超声波清洗器，KH-300DE，昆山禾创产生仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 原料的预处理

将9种食用菌置于电热鼓风干燥箱内在40℃干燥20 h，使食用菌充分干燥。取出，用粉碎机将其粉碎，过80目筛，干粉包装密封，备用。

1.4.2 样品提取液制备

称取上述备用9种食用菌粉5.0 g，置于锥形瓶中，按照料液比1∶3的比例加入纯甲醇溶液，超声提取30 min后，过滤，重复以上步骤2次，合并3次滤液，真空干燥后得9种食用菌甲醇提取物，称取甲醇提取物0.1 g，甲醇定容至10 mL容量瓶中，作为储备液待用。

1.4.3 DPPH自由基清除能力测定

取1.0 mL不同浓度的甲醇提取液加入到2.0 mL浓度为35 mL/L的DPPH溶液中，在室温下，以100 r/min，离心30 min后，于517 nm处测定9种食用菌不同浓度甲醇提取液的吸光度。以抗坏血酸作为阳性对照，并计算DPPH自由基清除能力。

式中：A0为空白组，即为不加入样品溶液的DPPH体系的吸光度；A为加入样品溶液的吸光度。

1.4.4 还原能力测定

采取铁氰化钾还原法[4]：分别量取2.5 mL不同浓度的甲醇提取物溶液，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液，2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀，50℃恒温20 min后，体系中加入2.5 mL体积分数10%的三氯乙酸，以2 200 r/min离心15 min，取上清液5 mL，再加入蒸馏水5 mL，0.1%的FeCl3溶液1 mL，于700 nm处测定吸光度，吸光度越高，证明还原能力越强。

1.4.5 羟基自由基清除能力测定

取8支10 mL的比色管，依次在1 mL pH 8.2的Tris-HCl溶液中，加入0.3 mL 7.5 mmol/L的磷酸亚铁铵溶液，0.3 mL 7.5 mmol/L的邻二氮菲溶液。其中1号作为空白组，3～8号加入1 mL不同浓度的羊肚菌甲醇提取液，2～8号中加入1 mL 7.5 mmol/L的H2O2溶液，最后将1～8号比色管定容至10 mL，置于37℃水浴中充分反应1 h后，取出，于510 nm处测定吸光度，并计算相应的羟基自由基清除能力。其他8种食用菌同法测定。

式中：A1和A2分别为体系不加H2O2和加H2O2时的吸光度，A3为加入甲醇提取物溶液后的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 DPPH自由基清除能力测定

DPPH分子是一种人工合成且稳定的有机自由基，其结构中含有3个苯环，1个N原子上有一个孤对电子[5]。其甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在515～520 nm范围有最大吸收峰[6]。当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，呈深紫红色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因此可通过测定其吸光度进行定量分析[7-8]。清除DPPH自由基是DPPH法的根据[9]。9种食用菌甲醇提取物对DPPH自由基的清除能力有所差别，为了评价9种食用菌甲醇提取物的抗氧化能力和自由基清除能力，选择清除率为50%时9种食用菌甲醇提取物的浓度(EC50)作为评价指标，EC50值越小，其清除自由基能力越强。9种食用菌甲醇提取物的DPPH自由基清除结果见图1、图2。

图1 食用菌甲醇提取物的DPPH清除自由基能力

图2 食用菌甲醇提取物的DPPH清除自由基能力

由图可知：9种食用菌甲醇提取物对自由基清除能力均随着浓度增加有显著的提高，当达到一定浓度时，清除能力不再增加，且由其拟合曲线可得出半数清除浓度（EC50），羊肚菌、圆孢蘑菇、杏鲍菇、香菇、圆菇、白玉菇、平菇、金针菇和姬菇的EC50分别为 563.72、346.50、1 892.99、2 155.21、1 427.06、1 581.34、1 002.17、2 106.11和1 201.66 μg/mL。

9种食用菌对DPPH自由基的清除能力由大到小依次为：圆孢蘑菇＞羊肚菌＞平菇＞姬菇＞圆菇＞白玉菇＞杏鲍菇＞金针菇＞香菇。抗坏血酸EC50可达到48.09 μg/mL，均高于9种食用菌。其中，某些食用菌会随着其浓度增大到一定程度时清除率会降低，可能是由于，食用菌浓度增大以后提取液颜色加深，对吸光度的测定有影响，从而影响清除率。另一方面，一定浓度下DPPH溶液中，提供的自由基有限，随着反应物增多从而达到饱和。

结果表明，圆孢蘑菇、羊肚菌甲醇提取物虽低于抗坏血酸DPPH自由基清除能力，但明显高于其他7种食用菌。

2.2 还原能力测定

抗氧化物质提供电子能力的重要指标可以用还原能力表示，其通过提供电子可以使自由基变成稳定的分子，从而失去活性[4]。许多研究证实抗氧化活性同还原力是密切相关的[10]。本文通过铁氰化钾还原法测定9种食用菌的还原能力。9种食用菌还原能力测定即铁氰化钾还原法测定结果如图3、图4。

图3 食用菌甲醇提取物还原能力测定

由图可知：当甲醇提取物浓度为6 000 μg/mL时，羊肚菌还原能力最强，且羊肚菌、平菇、金针菇和香菇还原能力仍呈上升趋势。以拟合曲线比较9种食用菌还原能力发现，羊肚菌和圆孢蘑菇无论在低浓度时还是高浓度时都具有很高的还原能力，姬菇还原能力较弱，其他6种食用菌还原能力基本相似。

2.3 羟基自由基清除能力测定

图4 食用菌甲醇提取物还原能力测定

自由基是引起人类疾病以及衰老的重要因素[11]，在人体内的所有自由基中，羟基自由基是最活泼也是最具有毒性的。羟基自由基可以和细胞中的所有分子，例如有机酸、磷脂、氨基酸、糖类和核苷等快速反应并对机体造成损害。所以，羟基自由基清除能力是反映外物对人体抗氧化性的重要指标。9种食用菌羟基自由基清除能力测定结果如图5、图6。

图5 食用菌甲醇提取物的羟基自由基清除能力测定

图6 食用菌甲醇提取物的羟基自由基清除能力测定

由图可知：9种食用菌甲醇提取物羟基自由基清除能力均随着浓度增加有显著的提高，当达到一定浓度时，清除能力不再增加，且由其拟合曲线可得出半数清除浓度（EC50），羊肚菌、圆孢蘑菇、杏鲍菇、香菇、圆菇、白玉菇、平菇、金针菇和姬菇的EC50分别为：939.84、945.88、1 297.10、1 346.94、1179.35、1 427.61、863.74、1 005.54和1 272.18μg/mL，9种食用菌对DPPH自由基的清除能力由大到小依次为：平菇＞羊肚菌＞圆孢蘑菇＞金针菇＞圆菇＞姬菇＞杏鲍菇＞香菇＞白玉菇。抗坏血酸EC50可达到85.03 μg/mL，均高于9种食用菌。结果表明，9种食用菌甲醇提取物对羟基自由基清除能力与DPPH自由清除能力有所差别，以平菇最高。

3 总结

本文从DPPH自由基清除能力、还原能力和羟基自由基清除能力3个方面评估了羊肚菌、圆孢蘑菇、杏鲍菇、香菇、圆菇、白玉菇、平菇、金针菇和姬菇9种食用菌甲醇提取物的抗氧化活性。综合以上3个实验结果得出，羊肚菌、圆孢蘑菇、平菇在不同抗氧化途径中均具有良好的抗氧化活性，说明食用菌中含有某些具有抗氧化能力的化合物。本文研究的缺陷是未对9种食用菌水提物的抗氧化性能进行实验，从而无法进行比较，后续将继续进行研究。但研究结果仍然可为食用菌中天然的抗氧化成分提取分离制备，及其在医药、食品和化妆品应用研究开发提供依据。

[1]Thannickal V J，Fanburg B L.Reactive oxygen species in cell signaling[J].Ajp Lung Cellular&Molecular Physiology，2001，279(6)：L1005-L1028.

[2]Halliwell B，Whiteman M.Measuring reactive species and oxidative damage in vivo，and in cell culture：how should you do it and what do the results mean[J].British Journal of Pharmacology，2004，142(2)：231-255.

[3]唐鹏，李学英，王大忠.食用菌多糖药理作用研究进展[J].临床合理用药杂志，2014(17)：176-178.

[4]黄俊丽，张慜.松茸、黑牛肝菌、双孢白蘑菇提取物体外抗氧化性试验研究[J].食品与生物技术学报，2011，30(3)：342-347.

[5]Eklund P C，Långvik O K，Wärnå J P，et al.Chemical studies on antioxidant mechanisms and free radical scavenging properties of lignans[J].Organic&Biomolecular Chemistry，2005，3(3)：3336-3347.

[6]Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food Science and Technology，1995，28(1)：25-30.

[7]Shimada K，Fujikawa K，Yahara K，et al.Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，1992，40(6)：945-948.

[8]Kumaran A，Karunakaran R J.Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus[J].Food Chemistry，2006，97(1)：109-114.

[9]Karioti A，Mensah M H.Composition and Antioxidant Activity of the Essential Oils of Xylopia aethiopica(Dun)A.Rich.(Annonaceae)Leaves，Stem Bark，Root Bark，and Fresh and Dried Fruits，Growing in Ghana[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，2004，52(26)：36-43.

[10]王根女.紫苏中酚类物质的微波辅助提取工艺及其抗氧化能力研究[D].杭州：浙江大学，2010.

[11]牛育鸿，陈娅萍.运动、由基与衰老研究[J].榆林学院学报，2009，19(2)：17-19.

Antioxidant Activities of Nine Edible Mushrooms Extracts

ZHAO Ying1，2，LIU Xiao-hui3，LIU Xiao-cui1，2，LU Yong-chang1,2∗
(1.College of Pharmacy，Qinghai University for Nationalities，Xining Qinghai,810007;2.Key Laboratory of plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research，Xining Qinghai,810007;3.College of Chemistry and Chemistry Engineering，Qinghai University for Nationalities，Xining Qinghai,810007)

This is a study of antioxidation activities of nine methanol extracts by ability of scavenging DPPH free radical，reducing power and hydrogen peroxide scavenging activity.Including Morehella esculenta(L.)Pers，Agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton，Pleurotus eryngii Quel.，Lentinus edodes(Berk.)sing，Mushroom，Pleurotus nebrodensis，Pleurotus ostreatus，F.velutipes and Pleurotus ostreatus.The results showed that there are different antioxidant activity of nine methanol extracts of edible mushroom species，the methanol extract of Agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton showed the strongest 2，2-diphenyl-1-picryhydrazyl(DPPH)scavenging capacity，and the EC50 values was 346.50μg/mL，respectively.The methanol extracts of Morehella esculenta(L.)Pers showed the strongest reducing power.And the methanol extracts of Pleurotus ostreatus showed the strongest Hydrogen peroxide scavenging activity，the EC50 of 863.74μg/mL.

morehella esculenta(L.)Pers;agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton;pleurotus ostreatus；antioxidant activity

S567.3

A

1674-0874(2017)02-0028-05

〔责任编辑 杨德兵〕

2017-02-08

赵英(1993-)，女，山西运城人，在读硕士，研究方向：药物分析专业。∗卢永昌，男，教授，通信作者。