胃癌相关纤维母细胞中miRNAs的表达及对癌细胞迁移和侵袭的影响

闫 玉，王瑞芬，乔 萌，王立峰

胃癌相关纤维母细胞中miRNAs的表达及对癌细胞迁移和侵袭的影响

闫 玉，王瑞芬，乔 萌，王立峰

目的 观察胃癌相关纤维母细胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)中多种微小RNAs(microRNAs, miRNAs)的表达水平，并探讨CAFs中miRNA-214的表达对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法 原代培养人胃黏膜正常纤维母细胞(normal fibroblasts, NFs)和胃CAFs，采用RT-PCR检测NFs和CAFs中多种miRNAs表达水平；利用Transwell小室建立CAFs与胃癌细胞MGC-803相互作用的体外模型，分析CAFs中miRNA-214对MGC-803迁移和侵袭能力的影响。结果 与NFs相比，18种miRNAs在CAFs中的表达均有差异。其中miRNA-214在NFs和CAFs中的表达差异最显著，且在CAFs中低表达。Transwell迁移和侵袭实验结果显示，上调CAFs中miRNA-214的表达水平明显抑制胃癌细胞MGC-803迁移和侵袭能力(P<0.01)。结论 人胃癌微环境中CAFs和NFs的miRNAs表达差异有显著性，其中miRNA-214在CAFs中的表达明显降低；过表达CAFs中的miRNA-214可以显著降低胃癌细胞的迁移和侵袭能力，在胃癌进展中发挥抑制作用。

胃肿瘤；癌相关纤维母细胞；miRNA-214；迁移；侵袭

癌相关纤维母细胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境中最为丰富的间质细胞成分，在肿瘤演进过程中扮演重要角色[1]。研究表明，CAFs中微小RNAs(microRNAs, miRNAs)的异常表达可参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等多种生物学行为[2-3]。目前，关于胃CAFs中miRNAs的生物学功能及作用机制研究尚不多见。本文利用RT-PCR技术检测了原代培养的胃CAFs和正常纤维母细胞(normal fibroblasts, NFs)中18种miRNAs的相对表达水平，根据检测结果进一步观察在CAFs和NFs中表达差异最显著的miRNA-214对胃癌细胞迁移和侵袭的影响，探讨其在胃癌进展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌MGC-803细胞系购自中国科学院上海生命研究院细胞资源中心。兔抗人FAP单克隆抗体购自Abcam公司，鼠抗人Cytokeratin单克隆抗体和兔抗人vimentin单克隆抗体购自Dako公司；细胞RNA提取试剂Trizol、PrimeScript RT试剂盒及SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自大连宝生物公司(Takara公司)，miRNA引物购自上海生工公司；转染试剂脂质体Oligofectamine购自GenePharma公司，Lipofeetamine 2000购自Invitrogen公司；用于细胞培养的试剂购自Hyclone公司，Tanswell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 NFs和CAFs的原代培养及纯化 自手术室取胃癌组织新鲜标本，同时选取相应的正常胃黏膜作为对照。在无菌操作台内剪成碎末状后加入0.1%胶原酶，置于37 ℃温箱中孵育消化，直至消化液中有大量悬浮的单个细胞或细胞团，然后用200目滤网过滤离心，加入含20%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基重悬，接种于培养皿中，放置37 ℃、5%CO2培养箱中。48 h后第1次换液，以后每2～3天换液，直至细胞长满瓶底。然后进行常规细胞传代，第3代可做细胞鉴定。4～10代的细胞用于后续实验。

1.2.2 条件培养基的制备 将细胞接种于10 cm培养皿中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中常规培养，待其细胞密度达70%～90%时换用无血清的DMEM培养基8～10 mL继续培养48 h，收集细胞培养液，3 000 r/min离心20 min，吸取上清-80 ℃冻存备用。

1.2.3 免疫细胞化学染色 常规细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，设立阴性对照和阳性对照，应用SP法进行免疫细胞化学染色，一抗为兔抗人FAP单克隆抗体, 鼠抗人Cytokeratin单克隆抗体，兔抗人vimentin单克隆抗体，实验过程严格按照试剂盒说明书进行。以胞质中出现黄色或棕黄色颗粒视为阳性染色。

1.2.4 miRNAs的筛选 查阅大量文献，选择18个与CAFs相关的miRNAs：miRNA-31、miRNA-155、miRNA-483-3p、miRNA-26a、miRNA-148a、miRNA-93、let-7g、miRNA-106b、miRNA-424、miRNA-149、miRNA-199a、miRNA-21、miRNA-34b、miRNA-101、miRNA-301a、miRNA-145、miRNA-143、miRNA-214。

1.2.5 RT-PCR Ttizol试剂提取细胞总RNA 以500 ng总RNA为模板，用PrimeScript RT试剂盒逆转录生成cDNA，并以2 μL cDNA进行扩增，以U6作为内参。所有反应设3个复孔。采用2-△△Ct法计算各组 miRNA的相对表达水平。

1.2.6 miRNA模拟物的转染 取对数生长期的CAFs细胞每孔1×105个接种于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，待其细胞密度达70%～90%时，以转染试剂Lipofeetamine 2000介导转染miR-214 mimic及阴性对照加入6孔板中，然后用无血清的Opti-MEM培养基继续培养4～6 h后，换成完全培养基继续培养48 h。

1.2.7 Transwell迁移和侵袭实验 将收集的条件培养基加入下室中，每孔加500 μL。向上室加入200 μL无血清的胃癌细胞MGC-803悬液(细胞数为2×105个)，置于细胞培养箱中培养。48 h后取出小室，用棉签轻轻擦去上室残留的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色15 min后，置于倒置光学显微镜下观察，选取上、下、左、右和中心5个视野计数穿膜细胞数并拍照，取其平均数。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，两组数据的比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NFs和CAFs的鉴定 已纯化的NFs细胞形态比较规则，细胞较小，呈长梭形；CAFs虽呈长梭形，但形态差异较大，大小不等，排列紊乱。免疫细胞化学鉴定结果表明，原代培养的NFs和CAFs均表达间叶细胞标志vimentin(图1A、B)，但均不表达上皮细胞标志Cytokeratin(图1C、D)。纤维母细胞激活蛋白(fibroblast activation protein, FAP)是CAFs的重要细胞标志物之一，在CAFs中高表达。本组免疫细胞化学结果显示，CAFs中FAP的蛋白表达量明显高于NFs(图1E、F)。以上结果证明实验成功分离纯化了NFs和CAFs。

ABCDEF

图1 正常纤维母细胞与癌相关纤维母细胞的免疫细胞化学染色鉴定：A.正常纤维母细胞中vimentin阳性；B.癌相关纤维母细胞中vimentin阳性；C.正常纤维母细胞中Cytokeratin阴性；D.癌相关纤维母细胞中Cytokeratin阴性；E.正常纤维母细胞中FAP弱阳性；F.癌相关纤维母细胞中FAP强阳性，SP法

2.2 NFs和CAFs中多种miRNAs的表达差异 在所检测的18种miRNAs中，miRNA-31在CAFs中的表达明显增多，约是NFs中的1.7倍；miRNA-214、143和145在CAFs中的表达明显减少。其中miRNA-214在NFs和CAFs中的表达差异最显著，其在CAFs中的表达含量约是NFs中的1/4(图2)，因此选取该miRNA为研究对象进行进一步研究。

图2 RT-PCR检测18种miRNAs在正常纤维母细胞和癌相关纤维母细胞中的表达

2.3 miRNA-214转染效率的验证 RT-PCR结果显示，与阴性对照组相比，上调miRNA-214组的CAFs细胞中miRNA-214表达水平是阴性对照组的91.1倍，差异有统计学意义(P<0.01，图3)，表明转染成功。

图3 RT-PCR检测癌相关纤维母细胞转染后阴性对照组和上调miRNA-214组中miRNA-214的表达，**P<0.01

2.4 CAFs中miRNA-214上调对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响 Transwell小室迁移实验结果显示，用收集的条件培养基培养癌细胞48 h后，上调miRNA-214组穿过滤膜的MGC-803细胞数为(48.7±3.2)，明显低于阴性对照组(96.3±4.2)(图4)，差异有统计学意义(P<0.01)，说明miRNA-214具有抑制胃癌细胞迁移的功能。在Transwell小室侵袭实验中，上调miRNA-214组穿过基质胶和滤膜的MGC-803细胞数为(35.7±3.1)，明显低于阴性对照组(69.3±5.1)(图5)，差异有统计学意义(P<0.01)，说明miRNA-214具有抑制胃癌细胞侵袭的功能。

④A④B⑤A⑤B

图4 癌相关纤维母细胞中miRNA-214表达水平改变对胃癌细胞MGC-803迁移能力的影响：A.阴性对照组；B.上调miRNA-214组 图5 癌相关纤维母细胞中miRNA-214表达水平改变对胃癌细胞MGC-803侵袭能力的影响：A.阴性对照组；B.上调miRNA-214组

3 讨论

肿瘤的发生、发展是多步骤、多因素参与的极其复杂的过程，涉及肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与微环境之间的相互作用。而肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用是促进癌细胞侵袭和转移的重要因素[4]。CAFs是一种活化的纤维母细胞，其作为肿瘤微环境中最重要的一种间质细胞，在肿瘤的恶性进展过程中扮演着重要角色[5]。越来越多的证据表明，CAFs可分泌多种生长因子和细胞因子，通过诱导癌细胞增殖、血管生成和细胞基质降解等作用促进肿瘤生长和侵袭转移[6-8]。

miRNAs是一类长度约22个核苷酸的小分子单链非编码RNA，通过与靶基因mRNA的3′非编码区(3′untranslated region, UTR)结合在转录后水平调控多种基因的表达，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等多种生物学行为，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要功能[9-11]。但以往关于miRNAs的研究主要集中在癌细胞本身。最近研究发现，CAFs中也存在某些miRNAs的异常表达，并通过调控其下游多种靶基因的表达影响肿瘤的进展[12]。如在口腔鳞状细胞癌CAFs中，miRNA-148a可通过下调Wnt10b降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，在一定程度上抑制了肿瘤的进展[13]。Tang等[14]在乳腺癌CAFs中研究显示，miRNA-200s的低表达可增强CAFs的活性，从而促进癌细胞的转移。本组实验发现，在所挑选的18个与CAFs相关的miRNAs中，miRNA-214、143和145在CAFs中的表达明显低于NFs，其中miRNA-214在NFs和CAFs中的表达差异最显著，说明CAFs中的miRNA-214可能在胃癌的发生、发展过程中发挥重要作用。

现有研究表明，miRNA-214在CAFs中的表达异常与肿瘤的恶性进展密切相关[15]。而胃CAFs中miRNA-214的异常表达对胃癌细胞的生物学行为是否有影响，尚未见相关文献报道。为证实胃CAFs中miRNA-214对癌细胞迁移和侵袭能力的影响，本实验将miRNA-214的模拟物及阴性对照分别瞬时转染至原代分离纯化的CAFs中，RT-PCR结果显示，与阴性对照组相比，上调miRNA-214组的CAFs细胞中miRNA-214表达水平显著提高，表明转染成功。然后我们用转染后的CAFs条件培养基培养胃癌细胞MGC-803，并利用Transwell小室观察胃癌细胞迁移和侵袭能力变化。结果发现，miRNA-214上调组的CAFs条件培养基能够有效地降低胃癌细胞MGC-803的迁移和侵袭能力，这说明CAFs中的miRNA-214可能抑制胃癌的进展。

既然胃CAFs中的miRNA-214有抑制癌症进展的作用，那么胃癌细胞中的miRNA-214又发挥怎样的功能呢？目前关于miRNA-214在胃癌细胞中的生物学作用存在不同观点。Wang等[16]检测了80对正常胃黏膜和癌组织中miRNA-214的表达水平，发现胃癌组织中miRNA-214的表达含量低于正常胃黏膜组织，而且该研究还发现miRNA-214可通过靶向抑制集落刺激因子1(colony stimulating factor 1, CSF1)的表达降低癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。然而Yang等[17]的研究结果则不同，他们发现miRNA-214可通过靶向抑制PTEN的表达促进胃癌细胞迁移和侵袭，发挥着促癌作用。这可能由于miRNA-214可以靶向调节多个靶基因，通过调控不同的信号传导途径发挥不同的生物学功能。但在胃癌细胞中miRNA-214的哪个靶基因发挥主要作用，还需更多的分析。

综上所述，本实验初步证实miRNAs在胃CAFs与NFs中的表达具有差异性，其中miRNA-214在CAFs中的表达显著低于NFs。进一步研究结果表明，miRNA-214在胃CAFs中的过表达能够降低胃癌细胞迁移和侵袭的能力，可能发挥抑制肿瘤进展的作用。我们后续将对miRNA-214在胃CAFs中的具体作用机制进行深入探讨。

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Expression miRNAs in cancer associated fibroblasts of gastric cancer and their effects on the migration and invasion

YAN Yu, WANG Rui-fen, QIAO Meng, WANG Li-feng
(DepartmentofPathology,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)

Purpose To investigate various microRNAs (miRNAs) expression levels in cancer associated fibroblasts (CAFs) of gastric cancer, and to explore the effects of miRNA-214 in CAFs on the invasion and migration of gastric cancer cells. Methods The primary CAFs were isolated from human gastric tumor tissues, while the normal fibroblasts (NFs) were from adjacent normal gastric mucosa tissues. Real-time quantitative PCR (RT-PCR) was performed to detect the expression level of miRNAs in CAFs and NFs. The interaction modelinvitrobetween CAFs and MGC-803 (a gastric cancer cell line) was established by Transwell chamber, and then the effects of miRNA-214 in CAFs on MGC-803 invasion and migration were analyzed. Results It was found that the expression level of 18 kinds of miRNAs in CAFs was different. Moreover, the expression level of miRNA-214 in CAFs was most observably decreased compared with NFs. Further studies indicated that over-expression of miRNA-214 in CAFs could markedly inhibit the migration and invasion ability of gastric cancer cellsinvitro. Conclusion The expression of miRNAs was different between CAFs and NFs, and the miRNA-214 expression in CAFs is markedly reduced compared with NFs. The over-expression of miRNA-214 in CAFs could significantly inhibit the migration and invasion ability of gastric cancer cells. Therefore, miRNA-214 in CAFs might act as a tumor suppressor in gastric cancer progression.

gastric neoplasms; cancer associated fibroblasts; miRNA-214; invasion; migration

上海交通大学医学院附属新华医院院级课题(15YJ10)、上海市卫生和计划生育委员会青年项目(20154Y0145)、上海交通大学医工交叉课题(YG2016QN72)

上海交通大学医学院附属新华医院病理科，上海 200092

闫 玉，女，硕士，硕士研究生。Tel: (021)25077217，E-mail: 461529177@qq.com 王立峰，女，博士，主任医师，通讯作者。E-mail: wanglifeng@xinhuamed.com.cn

时间：2017-6-20 11:17 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.003.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)06-0601-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.003

接受日期：2017-03-27