规范化特殊染色技术对肺真菌感染性疾病病理诊断的意义

刘菲菲，李 雪，金木兰

规范化特殊染色技术对肺真菌感染性疾病病理诊断的意义

刘菲菲，李 雪，金木兰

目的 探讨规范化特殊染色技术在肺真菌感染性疾病病理诊断中应用的意义。方法 选取2011年9月～2016年3月北京朝阳医院最终病理诊断为肺真菌感染性疾病104例，行HE染色、HE染色联合传统手工特殊染色法染过碘酸雪夫氏染色(PAS)及六胺银和HE染色联合全自动特殊染色法染PAS及六胺银，将两种特染技术规范化比较，镜下观察分析结果(均为初次染色结果，不包括复染结果)，以最终病理诊断结果为标准，与临床初诊结果比较。结果 肺真菌感染性疾病确诊率和真菌分型率，从低到高顺序一致，为临床初步诊断(29.8%和19.2%)、HE染色法(32.7%和32.7%)、HE染色联合传统手工特殊染色法染PAS和六胺银(90.4%和87.5%)、HE染色联合全自动特殊染色法染PAS和六胺银(98.1%和94.2%)。这4种方法从两方面比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)，第4种方法与前两种比较方法差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)，与第3种方法比较确诊率差异有统计学意义(P<0.05)，分型率差异无统计学意义(P>0.05)。但全自动特殊染色法染PAS及六胺银操作步骤更简单，化学试剂规范化，无人工和环境因素影响，耗时短，脱片和复染张数更少。结论 HE染色法联合全自动特殊染色法染PAS和六胺银更加规范化，有助于提高肺真菌感染性疾病的确诊率和真菌分型率。

肺疾病；全自动特殊染色；规范化；真菌

随着近年来各种高效广谱抗生素、免疫抑制剂及抗恶性肿瘤药物的广泛使用，再加上器官移植、导管技术以及外科其他介入性治疗的全面成熟与发展，导致因条件致病性真菌所引起的系统性真菌感染日益增多[1]。而肺部真菌感染占深部真菌感染的首位，50%～60%侵犯支气管、肺[2]。但其症状、体征和影像学表现缺乏特异性，部分真菌感染病灶和炎症、结核、肿瘤病灶难以鉴别，易误诊，从而导致治疗方案的制定不够精确[3]。因此，快速、准确的诊断出真菌类型就显得尤为重要。但其实现的关键在于规范化、标准化病理技术的支持。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集首都医科大学附属北京朝阳医院2011年9月～2016年3月经最终病理诊断确诊为肺真菌感染性疾病104例。男性59例，女性45例，年龄20～82岁，中位年龄52.2岁。标本来源：支气管黏膜活检36例，肺穿刺活检16例，外科手术肺活检52例(开胸肺活检20例，电视胸腔镜肺活检32例)，患者具有基础病者占81%，以高血压、糖尿病为主占50%以上，其次恶性肿瘤约16%，肺结核约13%，还有其它少见基础病冠心病、哮喘、鼻窦炎、气管炎及风湿性关节炎等。治疗后好转94例(90.4%)，完全康复3例(2.9%)，死亡7例(6.7%)。

1.2 试剂及方法 (1)常规HE染色。(2)传统手工PAS染色步骤：切片脱蜡至水，入0.5%高碘酸液氧化10 min，流水冲洗2 min，蒸馏水洗2次，雪夫试剂染10～20 min，充分水洗。苏木精对比染色1 min，分化、返蓝、水洗，脱水，二甲苯透明，中性树胶封固(试剂盒购自珠海贝索公司)。(3)传统手工六胺银染色法：试剂(购自北京益利公司)：①六胺银贮备液：3%六次甲基四胺水溶液100 mL，5%硝酸银水溶液5 mL。临用时将两种液体混合呈乳白色，瞬间透明。②六胺银硼砂染色液：六胺银贮备液25 mL，蒸馏水25 mL，5%硼砂水溶液2 mL[4]。步骤：①切片脱蜡至水，5%铬酸水溶液氧化1 h，流水冲洗5 min。②浸入1%亚硫酸钠水溶液1 min，除铬酸，自来水冲洗5 min，蒸馏水充分洗涤。③置入六胺银硼砂染色液内60 ℃温箱1 h，至切片呈黄褐色，镜下观察真菌呈黑褐色为止。蒸馏水洗3次。④0.2%氯化金水溶液调色5 min，蒸馏水洗。⑤2%硫代硫酸钠水溶液3 min，自来水洗。⑥乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固[4]。(4)全自动特殊染色法染PAS和六胺银，均采用全自动特殊染色仪(型号NexEs，美国)，使用的PAS和六胺银染色试剂盒(75人次)购自罗氏诊断公司，PAS时长39 min，六胺银时长120 min，两种染色可同时进行，时长120 min。

1.3 分析方法 (1)病理技术规范化比较：通过比较传统手工特殊染色法和全自动特殊染色法在操作步骤的复杂程度、化学试剂的规范化、人工及环境因素影响、耗时、脱片和复染张数几方面，显示其两者之间的差异。(2)三种组合由一名主治和一名副高级医师进行镜下阅片并诊断：①HE染色。②HE染色联合传统手工特殊染色法染PAS和六胺银。③HE染色联合全自动特殊染色法染PAS和六胺银。结果再与临床初诊和最终病理诊断结果做比较，从肺真菌感染确诊率、真菌分型率和真菌类型分布比例几方面进行分析。

2 结果

2.1 传统手工特殊染色法和全自动特殊染色法规范化比较 传统手工特殊染色和全自动特殊染色相比，在操作步骤复杂程度(步骤数量和掌握难易度)、化学试剂规范化(是否为商品化试剂)，人工和环境因素影响(主要是人工控温、控时、控制染色效果及外界温、湿度等因素)几方面后者优于前者，并且后者染PAS和六胺银所需时间更短，为120 min，脱片、复染张数也较少，分别为2张(表1)。

2.2 肺真菌感染确诊率和真菌分型率比较 肺真菌感染确诊率和真菌分型率从低至高顺序一致，均为临床初步诊断31例和20例(29.8%和19.2%)、HE染色法34例和34例(32.7%和32.7%)(图1)、HE染色联合传统手工特殊染色法染PAS和六胺银94例和91例(90.4%和87.5%)、HE染色联合全自动特殊染色法染PAS和六胺银102例和98例(98.1%和94.2%)(图2、3)。这4种方法从两方面比较差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.01)，第4种方法与前两种比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)，与第3种比较确诊率差异有统计学意义(P<0.05)，分型率差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

2.3 真菌类型分布 最终病理诊断为肺真菌感染且分出类型者共100例，前3位是曲霉菌60例(60.0%)、隐球菌21例(21.0%)、毛霉菌17例(17.0%)。顺序相同者为HE染色联合传统手工特殊染色法染PAS和六胺银91例，曲霉菌55例(60.4%)、隐球菌20例(22.0%)、毛霉菌14例(15.4%)，HE染色联合全自动特殊染色法染PAS和六胺银98例，曲霉菌58例(59.2%)、隐球菌21例(21.4%)、毛霉菌17例(17.4%)。顺序不同者为临床初步诊断20例，曲霉菌13例(65.0%)、毛霉菌4例(20.0%)、隐球菌2例(10.0%)，HE染色法34例，曲霉菌27例(79.4%)、毛霉菌5例(14.7%)、隐球菌2例(5.9%)(表3)。

表1 两种特殊染色技术的规范化比较

表2 104例肺真菌感染确诊病例的4种诊断方法与最终病理诊断结果的比较[n(%)]

确诊率：确诊例数/总例数；真菌分型率：真菌分型例数/总例数

表3 104例肺真菌感染确诊病例4种诊断方法在真菌分布上与最终病理诊断结果的比较[n(%)]

①A①B①C①D②A②B②C②D③A③B③C③D

图1 真菌数量较多时，HE染色可以鉴别：A.曲霉菌；B.毛霉菌；C.隐球菌；D.肺孢子菌HE染色鉴别较为困难 图2 真菌的全自动特殊染色(曲霉菌、毛霉菌)：A.曲霉菌全自动PAS染色；B.曲霉菌全自动六胺银染色；C.毛霉菌全自动PAS染色；D.毛霉菌全自动六胺银染色；染色更明显，易辨别真菌结构，区分两种类型 图3 真菌的全自动特殊染色(隐球菌、肺孢子菌)：A.隐球菌全自动PAS染色；B.隐球菌全自动六胺银染色；C.肺孢子菌全自动PAS染色；D.肺孢子菌全自动六胺银染色；染色更突出，较易发现真菌及辨别其结构

3 讨论

近年来，肺真菌感染性疾病日益增多，但临床初诊的误诊率很高，分析原因：(1)肺真菌感染缺乏特异性临床表现。原发疾病的存在也会掩盖真菌感染的临床征象。(2)影像学上缺乏特异性。有些影像学表现酷似粟粒样结核，有些真菌感染所致结节和肿块影与肿瘤很难鉴别。(3)真菌感染病理改变主要为炎性浸润和肉芽肿性改变，与细菌性感染和结核无明显区别，致使病灶无特征性。(4)临床医师对肺真菌感染认识不足[5]。

肺活检组织病理学检查是确诊侵袭性肺部真菌感染的金标准[6-7]。参考侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)，对临床侵袭性肺部真菌感染的诊断标准[7]比较发现，只要具有组织病理学诊断即可确诊。获取方法有支气管镜黏膜/新生物活检、经支气管肺活检、CT引导下经皮-胸腔针刺肺活检、外科肺活检[8]，实验选取病例均由以上方法收集。有些国内文献多报道肺真菌感染主要为念珠菌肺炎[9-10]，原因是以痰或支气管灌洗液真菌培养作为诊断标准，而念珠菌为人类口腔的正常定值菌，20%～55%正常人的痰液中可以分离出念珠菌属。在非免疫缺陷患者侵袭性肺部真菌感染却很少见，发病率为0.2%～4.5%[10]，导致误诊。本实验以肺组织病理为标准，与国外报道[11-12]的诊断标准和肺部真菌感染曲霉菌占首位相一致。与国内近期文献报道的结果：肺真菌感染以曲霉菌占第1位，其次为隐球菌和毛霉菌，念珠菌肺炎少见[13]也相符合。上述文献均支持病理学检查是确诊该病的金标准。

对非肿瘤性肺疾病，按通常诊断顺序与原则，首先观察HE染色切片，在此基础上来决定是否需做特殊染色，六胺银及PAS染色常用来显示多数真菌[8]。光镜下，HE染色曲霉菌菌丝呈淡紫色，菌丝壁淡紫蓝色。也可用PAS染色，把菌丝染成品红色，理想的方法是用六胺银染色，可把菌丝染成棕黑色，少量的菌丝也易发现。HE染色也着染毛霉菌，PAS染色染色不佳，六胺银染色能很清晰地显示菌丝。在切片上曲霉菌和毛霉菌有时不易鉴别，特别是当毛霉菌的菌丝较狭窄，而菌丝里见到一些横隔的情况。一般来说，曲霉菌菌丝具有二叉型分支，直径较小，菌丝壁平行，有横隔，用六胺银法染色也较深[14]。隐球菌菌体HE染色呈淡红色或不着色，菌体外有透明区。常规HE染色下隐球菌易漏诊，PAS染色、GMS染色可提高阳性率[15]。肺孢子菌的HE染色见包囊壁不着色，呈透明的晕圈状，鉴别较为困难，一般加以六胺银染色，肺孢子菌包囊壁棕到黑色，结构显示清楚。而白色念珠菌HE染色其芽生孢子和假菌丝呈淡蓝色，两者同时见到才可以诊断。特别是急性期或陈旧性病灶更难兼备，需多方法联合诊断[14]。所以真菌在组织中用HE染色一般着色不佳，不留心观察易漏诊，因此需用特殊染色法显示，最常用的是PAS和六胺银[16]。只有当真菌数量多到一定程度时HE染色法才可以鉴别，所以漏诊几率很大，六胺银和PAS特殊染色作为辅助诊断必不可少。

两种实验方法结果与最终病理诊断结果真菌类型分布顺序一致，具有参考意义。从技术规范化比较可以观察到全自动特殊染色法染PAS和六胺银明显优于传统手工特殊染色法染PAS和六胺银。因为后者操作步骤复杂，对于操作者的技术要求高，化学试剂如六胺银染色部分还需人工配制，染色过程暴露于外界，染色效果需镜下观察、控制。结果受人工和环境因素影响，脱片和复染数大于前者，分别超出2例和8例，易造成误差或失误，缺乏严谨性。且前者脱片的2例，同于后者，说明与组织本身有关，与实验方法无关，侧面验证了前者结果的精准性。另外，染色效果不佳也是后者复染数多的主要原因(PAS 1张、六胺银5张)。在传统手工特殊染色法中，PAS染色步骤较简单，影响因素较少，实验结果相对稳定[17]，但染色的敏感性稍不如六胺银染色。从染色原理分析：可能是六胺银染色中的铬酸比PAS的过碘酸有更强的氧化能力，暴露出更多的醛基[18]。所以使得它更活跃而不易操作，如果温度过高或者染色时间过长都会使结缔组织着色太深，影响染色质量，影响结果的观察[17]，需每隔10 min镜下观察染色情况，因此耗时更长而不精准，特别是染色张数较多时。同样传统手工PAS染色耗时差异也较大，较高温度时为10 min，较低温度(冬季)为20 min左右。这些都是导致后者用时更长的原因，如有复染更延迟了出结果的时间。

特殊染色技术在相当一段时间对病理常规染色是一种辅助，在帮助病理医师完成病理诊断方面发挥着巨大作用[19]。但在化学试剂的购置、贮存、保管、使用、等方面存在许多问题。同时自行配置各类染色试剂，还受技术人员经验、技巧、能力及病理科规模，试剂使用周期等因素的影响，差别较大。而商品化试剂的使用会使特殊染色技术走向标准化、规范化，使操作变得简单、快捷、精准。全自动特殊染色法染PAS和六胺银使用了商品化试剂盒，不仅保证了结果的准确性，更加具有规范化和稳定性。再联合HE染色，对于肺真菌感染性疾病，无论从确诊率还是分型率，均比传统手工特殊染色法高，分别高出7.7%(8例)和6.7%(7例)。因此对该病的诊断是有意义的，有助于提高真菌感染的确诊率和分型率。

随着病理技术的发展，HE染色技术引用了全自动染色封片工作站，免疫组化染色也早已运用了全自动免疫组化染色仪，这些都为病理科实现标准化和质量控制提供便捷而可靠的工具，为临床病理诊断提供有力依据，对病理实验室的国际标准化发展接轨也起到重要作用。所以全自动特殊染色系统的运用也会是病理特殊染色技术发展的必然趋势。但由于试剂成本较高，对比国内组织化学特殊染色病理收费低的情况，阻碍了其推广和发展。而对于病理诊断它实现了传统手工特殊染色法向标准化、规范化的转型，提高了病理报告的精准性，缩短了发报告的时间，为临床快速制定有效的治疗方案给予了极大的帮助，值得提倡。

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Significance of standardized special staining technology for pathological diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases

LIU Fei-fei, LI Xue, JIN Mu-lan
(DepartmentofPathology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Purpose To explore the significance of the application of standardized special staining technique in pathologic diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases. Methods Final pathologic diagnosis of 104 cases pulmonary fungus infection disease in Beijing Chaoyang hospital from September 2011 to March 2016 were selected; HE staining only, HE staining combined with the traditional manual special staining method PAS and hexamine silver, and HE staining combined with automatic special staining PAS and hexamine-silver were used and compared. The two kinds of special staining technology were compared; the microscopic observation, analysis results (all the first staining results, not including the results of complex staining), the results on the basis of final pathologic diagnosis were also compared with the clinical preliminary diagnosis. Results Lung fungal infectious disease diagnosis rate and fungal classification rate, from low to high order consistence, showed that for the primary clinical diagnosis (29.8% and 19.2%), HE staining (32.7% and 32.7%), HE staining combined with traditional manual special staining method PAS and hexamine silver (90.4% and 87.5%), and HE staining combined with auto-matic special staining PAS and hexamine-silver (98.1% and 94.2%). The four methods were statistically significant on two aspects (P<0.01,P<0.01); the fourth method was significantly different from the first two (P<0.01,P<0.01). The fourth method was significantly different from the third kind of diagnosis rate (P<0.05), typing rate was no significant difference (P>0.05). But automatic special dyeing method of PAS and hexamine silver steps were more simple, with standardized chemical reagents, no artificial and environmental factors, short time-consuming, and less number of dropping-off and restaining of the section. Conclusion HE staining and its combination with automatic special staining of PAS and hexamine silver are much more standardized, and help to improve the diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases and fungal classification rate.

lung diseases; automatic special staining; standardization; fungi

首都医科大学附属朝阳医院病理科，北京 100020

刘菲菲，女，技师。E-mail: suiyinglff0123@126.com 金木兰，女，教授，博士生导师，通讯作者。Tel: (010)85231355，E-mail: kinmokuran@163.com

时间：2017-6-20 11:18 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.013.html

R 563；R 519

A

1001-7399(2017)06-0653-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.013

接受日期：2017-03-23