土壤中添加外源酚酸类物质对地黄生长的影响

李 娟，聂 铭，李 磊，陈 枫

(河南农业大学 农学院，河南 郑州 450002)

土壤中添加外源酚酸类物质对地黄生长的影响

李 娟，聂 铭，李 磊，陈 枫

(河南农业大学 农学院，河南 郑州 450002)

为了探索对羟基苯甲酸、香豆酸、阿魏酸、丁香酸、香草酸等一元酚酸类成分在地黄连作障碍中的作用，采用盆栽试验方法，以头茬和重茬地黄为对照，对受试地黄进行外源添加酚酸试验，对地黄的成活率、叶鲜重、根体积、根鲜重、光合色素含量、根系活力、细胞渗透性等方面的生长和生理指标进行比较研究。结果表明，5种单体酚酸及其混合物对地黄均有一定程度的毒害作用，其中，酚酸混合物对地黄成活的抑制情况与重茬地黄相似。酚酸处理对地黄地下部分生长的抑制作用要大于对地上部分生长的影响，各单体及组合酚酸处理对地黄叶片的光合色素含量影响不大，但均使地黄叶片的细胞膜透性显著增加，根系活力下降。据此推测，酚酸类物质对地黄具有较强的化感作用，是地黄的主要化感自毒物质。

地黄； 酚酸类物质； 化感作用； 自毒作用； 连作障碍

怀地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)是我国著名的“四大怀药”之一，以干燥块根入药，一直被视为药材中的上品。现代研究认为，地黄具有降血糖、保肝、止血、利尿、抗炎、抗真菌等作用。其块根及其加工品分别作为鲜地黄、生地黄和熟地黄入药，为中国传统的大宗道地中药材。据统计，目前在药品市场中有近1/4的中成药中含有地黄。

地黄是已知块根类药材中连作障碍最严重的药用植物，随着市场需求量的增加，连作障碍问题已经严重影响了怀地黄产业的可持续发展。针对地黄的连作障碍问题，近十余年，学者们从植物生理学、化学生态学、植物功能基因组学、代谢组学、蛋白质组学以及微生物宏组学等多个角度围绕连作地黄[1-7]及其根际环境[5-6,8-12]和消减技术[13-15]进行了大量的研究。研究结果表明，化感自毒作用是地黄连作障碍的主要原因，土壤中的酚酸类物质及其相互作用，改变了地黄根际的微生态环境，从而直接或间接影响地黄块根的各种生理生化性状。化感物质是引起地黄连作障碍的主要因素之一。

在引起作物连作障碍的众多化感物质中，酚酸类成分是目前研究最多、活性较强的一类化感物质。大量试验表明：酚酸类物质可能通过影响植物的膜系统、光合作用、酶活性、土壤微生物活性以及内源激素对植物生长产生抑制作用。本试验以连作地黄土壤中检测到的香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸等5种一元酚酸为对象，以头茬、重茬地黄为对照，用5种单体酚酸及其混合物处理地黄，通过检测地黄的成活率、叶鲜重、根鲜重、光合色素含量、叶片相对电导率、根系活力等生长和生理指标，探析酚酸类成分在地黄连作过程中的作用，验证一元酚酸类物质对地黄生长的“毒害”作用，为解决地黄连作障碍提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在河南省郑州市河南农业大学科教园区进行。试验用头茬土壤为未种植过地黄的土壤，重茬土壤为前一年种植过地黄的土壤，均为砂壤土。供试地黄品种为温85-5。块根繁殖材料芦头(种栽)由温县农业科学研究所提供。阿魏酸、香豆酸和对羟基苯甲酸购自国药集团化学试剂有限公司，香草酸、丁香酸购自美国ACROS公司。

1.2 试验方法

试验采取盆栽方式，设单体酚酸及混合酚酸共10个处理：对羟基苯甲酸(A)、香豆酸(B)、丁香酸(C)、阿魏酸(D)、香草酸(E)、对羟基苯甲酸和香豆酸混合(F)、对羟基苯甲酸和丁香酸混合(G)、香豆酸和丁香酸混合(H)、对羟基苯甲酸和香豆酸和丁香酸混合(I)、5种酸混合(J)，每组处理10盆重复。根据前期重茬土壤测试结果[5]，对羟基苯甲酸、香豆酸、丁香酸、阿魏酸、香草酸添加后在土壤中的浓度分别为1.790 0、0.020 0、0.003 3、0.033 3、0.013 3 μg·g-1，各处理添加的溶液体积均为200 mL。另设头茬(FC)、重茬(CC)各10盆作为对照。

盆栽采用常规田间管理，出苗10 d后定苗，每盆保留2棵地黄。出苗90 d后测定各处理组地黄成活率、叶片数、冠幅面积、叶片鲜重、光合色素含量、叶细胞膜渗透性、根体积(排水法)、根鲜重、根活性(TTC法)。

1.3 数据处理

试验采集的数据通过Excel 2010和IBM SPSS 19.0软件进行整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 外源添加酚酸类成分对地黄成活率的影响

由图1可知，与头茬地黄相比，重茬组地黄的成活率大幅降低。除丁香酸组(C)外，各处理地黄的成活率均小于头茬地黄，单一酚酸处理组的地黄成活率介于头茬与重茬之间，普遍高于混合酚酸组处理，混合酚酸处理的地黄成活率均低于重茬组。由此可知，单一酚酸处理对地黄成活率的影响较小，而混合酚酸可大幅降低地黄的成活率，如丁香酸单一处理对地黄成活率基本无不良影响，但当它与其他酚酸共同处理时则显著抑制地黄的成活率。

2.2 外源添加酚酸类成分对地黄生长的影响

由图2可知，重茬组地黄叶片鲜重低于头茬组地黄。除丁香酸(C)处理的地黄叶片鲜重接近于重茬组之外，其他各处理组的叶片鲜重均接近甚至高于头茬组，其中，对羟基苯甲酸(A)、阿魏酸(D)、香豆酸和丁香酸(H)组叶片鲜重大于头茬地黄。由此可知，除丁香酸(C)处理外，其他单体酚酸及酚酸组合处理对地黄地上部分生长的抑制作用不强。

图2 各处理对地黄地上部生长的影响

由图3可知，在根体积与根鲜重方面，头茬与重茬差异明显，头茬的平均根鲜重为31 g，平均根体积为32 cm3，而重茬地黄的平均根鲜重仅为7.7 g，平均根体积12 cm3，仅为头茬的24.8%和37.5%。单体酚酸与混酸处理对地黄根鲜重和根体积的影响较大，对羟基苯甲酸(A)、阿魏酸(D)、香豆酸和丁香酸混合(H)，以及5种酸混合(J)的根体积与根鲜重均高于头茬的水平，而香豆酸(B)、丁香酸(C)、香草酸(E)、对羟基苯甲酸和香豆酸混合(F)、对羟基苯甲酸和丁香酸混合(G)、对羟基苯甲酸和香豆酸和丁香酸三种酸混合(I)的根鲜重与根体积则介于头茬与重茬之间，其中，以丁香酸(C)处理对地黄地下部分的生长影响最大，其根体积和根鲜重分别为头茬的35.3%和32.6%。

2.3 外源添加酚酸类成分对地黄叶片光合色素含量的影响

由表1可知，与头茬地黄中所含光合色素含量相比，重茬组地黄不论是叶绿素a、b还是胡萝卜素的含量均大幅减少，分别为头茬地黄的58.1%，63.0%，59.9%。单体酚酸处理的各组中，除阿魏酸(D)组之外，各组的光合色素含量均比头茬有所降低，但远未达到重茬水平。各混合酚酸对叶绿素含量的影响除了香豆酸和丁香酸混合组(H)处理的地黄光合色素含量显著降低，对羟基苯甲酸和香豆酸混合(F)处理对地黄光合色素含量有促进作用之外，其余各组如对羟基苯甲酸和丁香酸混合(G)、对羟基苯甲酸和香豆酸和丁香酸混合(I)、五种酸混合组(J)均对光合色素含量影响不大。

图3 各处理对地黄地下部生长的影响

mg·g-1

注：FC，头茬；CC，重茬；A，对羟基苯甲酸；B，香豆酸；C，丁香酸；D，阿魏酸；E，香草酸；F，对羟基苯甲酸和香豆酸混合；G，对羟基苯甲酸和丁香酸混合；H，香豆酸和丁香酸混合；I，对羟基苯甲酸和香豆酸和丁香酸三种酸混合；J，5种酸混合。表2同。

2.4 外源添加酚酸类成分对地黄细胞膜透性及根系活力的影响

由表2可知，头茬地黄叶片的相对电导率最小，仅为0.12%，重茬地黄叶片的相对电导率是头茬的5倍，各处理的地黄叶片的相对电导率均高于重茬，其中，以丁香酸(C)处理地黄叶片的相对电导率最大。相对电导率是衡量细胞膜透性的重要指标，其值越大，表示电解质的渗漏量越多，细胞膜受害程度越重。由此可知，酚酸处理造成细胞膜结构受损，增加了地黄的细胞渗透性，改变了叶片细胞渗透压，不利于地黄正常的生长发育。

头茬和重茬组地黄的根系活力分别为0.70和0.44 ng·g-1·h-1，重茬组根系活力低于头茬组。

表2 外源添加酚酸对地黄细胞膜透性和 根系活力的影响

各处理均降低地黄的根系活力，其中，以香草酸(E)组根系活力最弱，仅为0.23 ng·g-1·h-1；香豆酸(B)、香豆酸和丁香酸混合(H)及对羟基苯甲酸和香豆酸和丁香酸混合(I)组次之，均低于重茬组，其他处理组的根系活力均介于头茬和重茬组之间。说明酚酸类物质可抑制地黄的根系活力，造成根系吸收不畅，源动力不足。

3 讨论

植物根系所处的土壤环境是一个非常复杂的微生态系统，其中的化学物质变化范围广且影响因素众多。因此，在田间情况下研究化感物质的作用特性难度很大。酚酸类物质是化感物质研究中的热点，也是存在争议最大的一类成分，很多针对酚酸类成分化感作用的研究均是在室内利用种子发芽试验进行生物测试得到结果，难以反映土壤中的复杂状况。也有人认为，酚酸类成分在进入土壤之后可能发生降解，且其存在于很多植物的根系分泌物中，不一定是造成连作障碍的主要化感物质。在地黄的连作障碍研究过程中，陈枫等[16]发现，对地黄的根际土壤水提液分部位进行化感自毒作用验证时，自毒作用较强的部位的确存在着数量较多、含量较大的一元酚酸类成分。Zhang等[12]的研究结果也表明，在地黄的根际土壤中，酚酸类物质的确存在着典型的距离效应，酚酸类物质在土壤中的含量与地黄根际距离呈显著相关。本试验的研究结果表明，外源添加酚酸类化合物可显著降低地黄的成活率，改变地黄的细胞膜渗透性，降低其根系活力，抑制地黄地下块根的生长，而对地上部分叶鲜重的影响较轻，这些与地黄在连作过程中的表现十分吻合，即早期地上部分生长正常，但中期出现大量死亡现象，即使存活也无法形成商品根。在研究中还发现，对地下部分生长影响最大的3种单体酚酸——香豆酸、香草酸和丁香酸，恰恰是在地黄根际土壤提取物分部位检测中化感作用最强的正丁醇和水部位出现的几种酚酸类成分[16]。这些都说明酚酸类物质在地黄的连作障碍形成过程中起着重要作用，是重要的化感自毒物质。另外，对光合色素的含量测定结果表明，重茬地黄的光合色素有较大幅度的降低，但本试验中仅部分酚酸单体及混酸处理能使光合色素含量少量降低，远达不到重茬水平，这反映出，连作对地黄光合色素的影响可能来自于其他化感物质的作用。

本试验中所涉及的5种一元酚酸类物质都属于苯丙素类化合物中的苯丙酸类，虽然5种酚酸化学结构相似，但每种酚酸类物质的物理、化学性质有所不同，对受体地黄根系细胞膜不同作用位点的亲和力也可能存在较大差异。Streibig等[17]对酚酸类物质化感作用的研究结果表明，不同的酚酸类物质对受体植物的影响程度是不同的。由于5种酚酸的结构、性质不同，对地黄根系细胞膜的作用力也随之有所区别，具有更强竞争力的酚酸往往能够捕获不止一个的作用位点(或至少干涉较近的其他位点)。当在地黄的根系细胞膜周围聚集了比分子总数更多的开放位点时，酚酸物质间的作用是增效的(在物质的浓度较低时出现的情况)；反之，若分子总数比细胞膜的位点更多时，这时具有更强竞争力的酚酸将能捕获到更多的作用位点，而竞争力较弱的酚酸捕获到的位点就少，由于2种酚酸化合物的作用效果没有得到充分的表达(在物质的浓度较高时出现的情况)，就会引起“拮抗作用”。这就解释了为什么不同的单体酚酸之间以及酚酸混合物处理之间的作用方式及效果存在着较大的差异，而其中的原理和构效关系，还需要进一步研究探索。

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(责任编辑：高 峻)

2017-03-16

国家自然科学基金(81373910，81102756)；河南省教育厅自然科学研究计划(2010B180012)

李 娟(1980—)，女，河南信阳人，博士，副教授，主要从事药用植物栽培学与化学生态学方面的研究工作，E-mail:juanli2003@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170625

S567.23+4

A

0528-9017(2017)06-0986-04

文献著录格式：李娟，聂铭，李磊，等. 土壤中添加外源酚酸类物质对地黄生长的影响[J].浙江农业科学，2017，58(6)：986-989.