不同环境因子对草履虫种群生长的影响

王兴达+曹英昆+霸婉玉+张奇+王小瑞+沈庆洲+张铁

摘 要：为了研究不同环境因子对草履虫种群生长的影响，培养出优质的草履虫，分别在pH梯度为：6.0、65、7.0、7.5、8.0，光照梯度为：0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx条件下培养草履虫，结果表明，小白菜培养液培养草履虫的最适pH值为7.0，并且相比于弱酸性环境，草履虫更适宜在弱碱性环境中生长。在光照为0 lx条件下，草履虫数量在第4天时达到最大值4 073 ind/100 mL，在光照为500～1 500 lx条件下，随着光照度的增加，草履虫的种群数量也随之增加。

关键词：草履虫；pH值；光照；种群密度

1 引言

1.1 研究背景

大草履虫（Paramecium caudatum）属原生动物门， 纤毛亚门， 纤毛纲，体长只有80～300 μm，由一个单细胞组成，是动物学教学常用的实验材料，也是实验生物学的重要材料[1]。它除了应激迅速外，还具有分布广泛，繁殖速度快，结构简单，便于采集培养以及观察的特点，在细胞生物学、分子遗传学、分子生物学、生物信息学、仿生学等研究领域得到了广泛的应用， 同时也是环境保护科学用来进行环境监测和水质净化的活性生物材料[2～3]。本文旨在探讨pH值和光照对草履虫种群密度的影响， 从而为实现在实验室条件下，短时间内大量培养出纯度高、性状稳定的草履虫，以及为草履虫在水体环境监测中的应用提供理论依据。

1.2 研究進展

草履虫是原生动物门的代表动物，对其采集、纯化及培养方面的研究，随着科研的进步，实验条件及设备的改进而不断发展。现有研究结果表明，23～27 ℃时大草履虫的分裂生殖最为旺盛，25 ℃为最适温度，低于10 ℃时不利于草履虫的繁殖[4]。当培养液酸性较强时（pH值为3.0和4.0），草履虫均死亡，草履虫仅能在弱酸性条件下正常生长，对酸的耐受范围在pH值5.0～7.0。当pH值高于9.0时，草履虫不能正常生长，草履虫只能在弱碱性条件下正常生长，对碱的耐受范围在pH值7.0～9.0。

2 材料及方法

2.1 实验材料烧杯、量筒、0～50 μL移液枪、纱布和皮筋若干、漏斗、载玻片，光学显微镜、电子天平、pH计、照度计等；新鲜的小白菜、氢氧化钠、浓盐酸等。

2.2 草履虫的采集和纯化

草履虫通常生活在水流速度不大，深度较浅的水沟、池塘和稻田中， 并且大多积聚在有机质丰富、光线充足的水面附近。当水温在24～27 ℃时， 繁殖最旺盛， 数目最多。草履虫的这些习性， 是确定采集地点和方法的重要依据[5]。采集时到附近的水沟、池塘边， 选择没有污染的地方， 用清洁的大烧杯沿水面采集水样， 这样的水中往往含有许多草履虫，并且在距根部 10 cm处剪下并拔出处于生长状态的芦苇，拔出时带有少量的泥土， 将此芦苇根部再剪成 2～3 cm小段放于烧杯中，注入清水，放在温暖明亮处。一周以后， 用显微镜检查可见许多草履虫。

上述采集到的草履虫，往往含有许多其它的小型生物以及杂质，要想获得纯度较高的草履虫，就必须经过分离纯化。具体采用微量分离法，即用50 μL移液枪吸取扩大培养后的培养液10 μL于干净载玻片上，在4倍显微镜下镜检，如发现草履虫及其它一些小型生物，将之转吸到另一块干净载玻片上，加10 μL小白菜培养液（小白菜培养液制作过程见2.3）按照1∶1比例稀释变成20 μL，用移液枪在同一块载玻片上再将其分成2滴，每滴10 μL，然后镜检，将含有草履虫的那一滴再加10 μL小白菜培养液再次按1∶1比例稀释变成20 μL，如此重复稀释3～5次后，直到在10倍镜下镜检确认已无其他生物为止。最后，将只含有草履虫的10 μL培养液吸入500 mL小白菜培养液中（在吸取时注意更换枪头以免混入其它生物），放于25 ℃光照培养箱中纯化培养1周，即可得到浓度较高的草履虫。若除草履虫外仍有较多其他生物及杂质，可重复用上述微量分离方法再次进行分离纯化。

2.3 培养液的制备

本实验主要采用小白菜培养液，取新鲜洁净的小白菜，用剪刀剪碎，按照2 g小白菜搭配自来水1 000 mL的比例， 将小白菜和自来水放入烧杯中， 加热煮沸10～15 min，停止加热。待冷却至室温，先后用双层纱布、滤纸各过滤一次，以免一些杂质混入培养液妨碍草履虫的计数观察。为了防止空气中其它原生动物的包囊落入以及蚊虫产卵， 烧杯口要用双层纱布包好， 然后放置在温暖明亮处进行细菌繁殖。经过24 h后，小白菜培养液即可用于接种使用。

2.4 接种

接种是指将扩大提纯后的草履虫转移到培养液的过程。按照上述分离提纯时所用的方法，接种时， 先将含有草履虫的液滴吸到干净的载玻片上，置于低倍显微镜下镜检， 如果发现液滴内只有草履虫， 可用移液枪将草履虫吸入到盛有小白菜培养液的250 mL小烧杯中进行繁殖。如果液滴内除了草履虫还有其它小型生物，可按照1∶1比例重复稀释3～5次后，直到液滴内只含有草履虫，才可用于接种。

2.5 培养

2.5.1 不同pH梯度下的培养

取100 mL小白菜培养液于250 mL小烧杯中，按以下pH值梯度：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 （用盐酸和氢氧化钠溶液调节培养液到相应pH值）， 配制5种培养液， 每种设3个重复组。在每瓶培养液中接种10个草履虫， 瓶口上方加盖双层洁净纱布，放在25 ℃的光照培养箱中培养，从第2天开始每隔24 h进行取样计数，每次计数完成后调节培养液到相应的pH值。

2.5.2 不同光照度下的培养

取100 mL小白菜培养液于250 mL小烧杯中，设置光照梯度分别在0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx，每个光照设3个重复，每个重复接种10个草履虫，瓶口上方加盖双层洁净纱布，放入25 ℃的恒温培养箱中培养，从第2天开始，每隔24 h进行取样计数。

2.6 观察计数

取样时，先把小烧杯摇匀，然后随机取9份样液，每份样液10 μL，滴在干净的载玻片上，用显微镜观察计数，即每次每组pH和光照条件下，同组3瓶各观察9份样液，共27份。当虫体数量较多时，草履虫的运动速度快，不便于计数观察，可采用擦镜纸纤维阻拦法，在一定程度上限制草履虫的运动。擦镜纸本身呈细密网络状， 质地薄而均匀，能很好地限制草履虫的运动， 观察效果极为理想。方法如下：把擦鏡纸剪成与盖玻片等大（或略大于盖玻片）的小方块， 放在载玻片上， 然后将草履虫培养液滴到擦镜纸上（不可太多， 以培养液正好能湿润擦镜纸为宜）， 然后盖上盖玻片观察[6]。镜检所有液滴内的虫数， 把每一瓶内9滴培养液的虫数相加即为90 μL的总数， 然后再计算出100 mL培养液中草履虫的个数。

3 结果与分析

3.1 不同pH值对草履虫种群密度的影响

pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的5组草履虫的数量见表1、图1，其中，pH7.0组草履虫生长最好，在第3天种群数量达到最大值。第3天后，弱碱性条件下2个组（pH值分别为7.5和80）草履虫的种群数量明显高于弱酸性条件下2个组（pH值分别为6.0和6.5）。从第2天开始，5个组的草履虫种群密度都在飞速上升，其中以pH值7.0组上升趋势最快，第3天达到最大值5 555 ind/100 mL，由此可知草履虫生长所需的最适pH值为7.0。5个组草履虫基本上到第2～3天种群密度达到最大值，弱碱性条件下的2个组（pH值分别为7.5和8.0）在第2天开始种群增长速度要高于弱酸性条件下的2个组（pH值分别为6.0和6.5），并且在以后持续几天内，数量变化趋势相对平稳，由此可知，草履虫更适于生长在中性及弱碱性的水体环境中。

通过方差分析可得 pH值为6.0与6.5组间草履虫的种群密度差异不显著（P>0.05），但与其它3组差异显著（P<0.05）；pH值7.0、7.5、80组间差异不显著（P>0.05），pH值7.0组增长最快。

3.2 不同光照度对草履虫种群密度的影响

草履虫体内不含有叶绿体，不能进行光合作用，目前没有光照与草履虫种群数量变化关系方面的相关研究。作者认为光照可能会在某一程度上影响草履虫的昼夜活动规律以及营养摄食。本试验中4种不同光照下各组草履虫的具体统计数量及变化见表2、图2。在光照为0 lx的条件下，草履虫的长势良好，从第2天开始草履虫的种群密度快速上升，并在第5天时达到最大值5 184 ind/100 mL。与有光照条件的其它3个组比较，无光照条件下的草履虫生长状况良好，并在第5天达到所有组的最大值，可见，光照的有无并不是制约草履虫生长繁殖的必要条件。在有光照的条件下， 1 500 lx组的草履虫数量在第3天为1 581 ind/100 mL，低于其它两组，但从第3天开始，草履虫大量分裂生殖，到第4天达到最大值4 073 ind/100 mL，其后两天均高于1 000 lx与500 lx 组。1 000 lx组与500 lx组相比无明显差异，但在第4天两组草履虫数量都达到最大值2 962 ind/100 mL以后， 1 000 lx组草履虫数量下降趋势平稳，表明1 000 lx比500 lx更有利于草履虫生长，在500～1 500 lx条件下，草履虫的种群密度随着光照的增强而增大。

通过方差分析可得，500 lx、1 000 lx和1 500 lx组间均无显著性差异（P>0.05）；0 lx与1 500 lx组间无显著性差异（P>0.05），但与其他三组差异显著（P<0.05）。在弱光条件下（低于1 500lx），草履虫的种群密度随光照的增强而增大；0 lx与500 lx，1 000 lx，1 500 lx三组相比差异显著（P<0.05），在无光条件（0 lx）下，草履虫的长势良好，最早达到最大生长密度。

4 讨论

pH值对动植物的生长有很大影响。何新华、张秋平等人在研究pH值对南美白对虾虾苗成活率的影响时发现pH值对白对虾虾苗影响非常大。水体环境的pH值为7.0～9.0时，虾苗的应激性较小，虾苗的存活率较高，为虾苗的适宜环境。在pH值为7.0以下及9.0以上时，虾苗的应激性非常大，虾苗不适应此环境[7]。不同动植物对pH值的耐受范围存在差异。有的生物对pH值的适应范围非常广，有的相对较窄，只适宜生活在特定的酸碱度下。甘志凯、张燕[8]认为在相当大的pH范围内（5.0～10.0）草履虫均能正常生长， 由此可见草履虫对酸碱的耐受范围很大、耐受性较强， 能够适应较为恶劣的生存环境；黄正一和蒋正揆[9]认为草履虫适宜在微碱性环境中生长，与本实验结果相近。本实验的研究结果表明，草履虫在pH值为7.0的条件下长势最好，并且相对于弱酸性条件（pH 6.0～7.0），草履虫更适宜在弱碱性条件（pH 7.0～8.0）下生长。

在水生动物生存的环境中，光是一个复杂的生态因子，它有多方面的生态作用，直接或间接地影响动物的趋光性、昼夜活动节律、群集活动、摄食以及生长发育等[10]。草履虫在数量较少时有一定的趋光性，即吸一滴带有草履虫的培养液于载玻片上，草履虫会趋于水滴向光的边缘带运动。草履虫体内不含有叶绿体，不能进行光合作用。作者认为光照不是影响草履虫种群生长的主要因素，但可能会在昼夜活动节律以及营养摄食等方面起到一些限制作用。所以作者设置4种光照条件，初步探索光照与草履虫种群生长的关系。实验结果表明，在光照为0 lx的条件下，草履虫的长势良好，在弱光条件下（低于1 500 lx），草履虫的种群密度随着光照的增强而增大。

参考文献：

[1] 袁聿军.草履虫的采集、培养与活体观察方法研究[J].实验室科学，2010，13（01）：139-141

[2] 杨春英，李娜.培养液及其浓度和pH值对草履虫种群增长的影响[J].微生物学杂志，2007， 27（4）：70

[3] Michaela C Strüder-Kypke， André-Denis G Wright， Sergei Fokin， et al.Phylogenetic Relationships of the Genus Paramecium Infered from Small Subunit rRNA Gene Sequences[J] .Molecular Phylogenetics and Evolution， 2000 ， 14（1）：122-130

[4] 許人和.温度对大草履虫（Parameciu mcaudatum Ehrenb.）分裂生殖速率的影响[J].新乡师范学院学报，1982（03）：111-115

[5] 龚军辉.草履虫的采集、培养和观察方法[J].高等函授学报（自然科学版），2003， 16（1）：41-43

[6] 张叶军.草履虫培养和观察实验的改进[J].科技视界，2013，10：132

[7] 何新华，张秋平，潘娟.pH值对南美白对虾虾苗成活率的影响[J].河北渔业，2015，12（002）：06

[8] 甘志凯，张燕.实验草履虫对酸碱耐受限度的测定[J].江西化工，2009，04（001）：131-134

[9] 黄正一，蒋正揆.动物学实验方法[M].上海科技出版社，1981：8-10

[10] 舒建英.浅议环境因子对水生动物的影响[J].宁夏农林科技.2009（06）：169-170

（收稿日期：2017-03-01；修回日期：2017-07-04）

Abstract：In order to study the influence of different environmental factors on the paramecium population growth， and provide a theoretical basis for the acquisition paramecium culture and environment monitoring， respectively， at pH gradient： 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0， light gradient： 0 lx， 500 Training under lx， 1 000 lx， 1 500 lx paramecium condition， results showed that cabbage broth culture paramecium optimum pH of 7.0， as compared to the acidic environment， paramecium more suitable for growing in a weak alkaline environment . In the light of the conditions under 0 Lx， Paramecium quantity in 4 days to reach a maximum 4 073 ind/100 mL， in the 500～1 500 lx illu mination conditions， light intensity increases， the number of paramecium population also increases.

Key words：paramecium； pH； light；population density