生理实验教学中开展大鼠脑片制备及观察实验的实践

周 辰, 高 珊,2, 魏 军, 毕 群

(1. 北京大学生命科学学院 生物学国家级实验教学示范中心, 北京 100871；2. 山东省医学科学院 基础医学研究所, 山东 济南 250062)

生理实验教学中开展大鼠脑片制备及观察实验的实践

周 辰1, 高 珊1,2, 魏 军1, 毕 群1

(1. 北京大学生命科学学院 生物学国家级实验教学示范中心, 北京 100871；2. 山东省医学科学院 基础医学研究所, 山东 济南 250062)

急性脑片是神经生物学研究中的重要材料,开展急性脑片制备的实验,有助于接触科学前沿、增加学习兴趣、提高教学质量。北京大学生理学实验课程组从2013年开始,尝试在选做实验部分开展大鼠急性脑片制备与观察的内容,至今已有112人完成了实验,取得了比较好的反馈。积累的教学经验为进一步开展与脑片相关的扩展实验提供了较好的基础,并且也为教学改革提供了思路和方向。

生理实验； 急性脑片； 振动切片

生理学实验是重要的基础课程之一,北京大学生命科学学院的教学计划中,生理学实验属于主干基础课,并与生理学理论课绑定,因此是必修课程。生理学实验的一个重要特点是经典实验比较多,主要的教学意义在于对理论课教学的辅助作用,同时锻炼学生的动手能力、合作能力、逻辑思维能力以及报告写作能力等。然而经典的实验内容在当前的科学研究中缺少实际应用,并且实验方法单一,不容易调动学生的学习积极性,不利于课程教学目的的实现。当前科学研究,特别是神经生物学研究中经常进行一些与生理学相关性较高的功能性实验。开展类似的实验教学,能够提高学生的学习兴趣,并且对科学前沿有一定的认识,获得更好的教学效果。但这些实验,如双光子在体成像通常需要使用大型仪器,不具备本科生教学的条件。此外有些实验操作复杂,例如膜片钳记录等,需要较长时间的练习,难以在一两次课程中掌握。这些都限制了在生理学实验课上开展科研中常用实验技术的内容。

离体脑片是神经生物学中常用的材料,特别是在电生理学实验中,离体脑片可以保持内部突触联系和神经回路,是非常重要的研究样本。在仪器方面,主要设备是振动切片机,国产产品价格相对较低。制备完成后的观察需使用正置显微镜及红外CCD,由于通过电脑屏幕显示图像,因此可以允许较多的学生进行观察。在操作方面,脑片制备步骤明确,难度适中,对初学者要求有细心、耐心和较好的合作,既可以锻炼培养学生的实验计划性、细致性、合作意识及实际动手能力,在实验结果上又有很大可能在脑片中观察到存活的神经元,收到有效的教学结果,对学生产生正向激励作用。因此，离体脑片制备及观察实验在本科生教学中开展,提供了一个能够了解科研常用方法的内容。

1 实验材料与试剂

使用出生后14天的SD大鼠乳鼠进行脑片制备。解剖液配方：NaCl,64 mM；NaHCO3,25 mM；CaCl2,0.5 mM；MgSO4,3.3 mM；KCl,2.5 mM；Na2HPO4,1.25 mM；葡萄糖,10 mM；蔗糖,120 mM。人工脑脊液(aCSF)配方：NaCl,125 mM；NaHCO3,25 mM；CaCl2,2 mM；MgSO4,1 mM；KCl,3 mM；Na2HPO4,1.25 mM；葡萄糖,10 mM。麻醉剂：乌来糖(氨基甲酸乙酯),20%(质量体积百分比)。

2 实验仪器

振动切片机KD-400型(浙江金华科尔诺电子科技有限公司)；正置显微镜BX51WI(奥林巴斯(中国)有限公司)；红外CCD IR-1000(美国DAGE-MTI公司)；正置显微镜X-Y移动平台BX-51-XY(上海思岩实业有限公司)。

3 实验方法

3.1 实验前准备

由于脑片制备所需的溶液需提前配制,并用氧气饱和1 h以上,因此由教师在课前准备。按照200 mL/人的数量配制解剖液,按照100 mL/人的数量配制aCSF,提前将部分解剖液冻成冰块。切片所需刀片为双面剃须刀片,分为2部分后用100%乙醇浸泡去除油脂。上课前1 h将解剖液放入4 ℃的水浴或冰中预冷,aCSF放置在室温下,2种溶液均通入95%氧气和/5%二氧化碳混合气进行饱和。

3.2 取脑

在手术前准备2个10 cm直径的塑料皿,分别倒入预冷的充氧解剖液,并放入解剖液制成冰块维持温度。从乙醇中取出刀片固定在刀片架上,刀片与水平面成15～20°角。振动切片机脑片槽中加入预冷的

充氧解剖液,放入解剖液制成的冰块并通入氧气/二氧化碳混合气。取出生后14 d的SD大鼠乳鼠,腹腔注射0.5 mL麻醉剂,以能够快速麻醉为准。小心剪去头皮,暴露颅骨,用剪刀快速剪下头部,放入塑料皿中的预冷解剖液内,沿矢状缝剪开并剥离头骨,使用不锈钢勺挖出完整大脑,放入另一个塑料皿的预冷解剖液中。

3.3 切片

取出的大脑背侧向上放置,用刀片垂直切去小脑和前脑,并放在刀片上离开液体,用滤纸小心吸干周围水分,在切片台上滴加502胶水,前脑切断面向下固定在切片台上。快速吹干胶水,粘牢后将切片台固定在切片槽中,保证大脑浸入预冷的充氧解剖液。

启动振动切片机,以较低的前进速度和较高的振动速度进行切片,厚度300～400 μm。每个切片完成后可用毛笔将其与全脑分离,并用粗口塑料吸管吸出切下的脑片放入充氧的室温aCSF中孵育1 h以上。

3.4 观察

脑片孵育完成后,用吸管转移到灌流槽中,放置在正置显微镜下观察,通过红外CCD成像,显示脑内结构及神经元形态。

4 结果

在教师示范后,学生自行完成大鼠脑片制备,在高倍镜下可以观察到脑内神经元。由于红外成像的分辨率较差,因此神经元与周围背景的区分比较模糊。在海马区可见密集排列的锥体细胞(见图1),其他区域也可观察到神经元数量较多的区域(见图2),在这些区域中能够观察到的神经元多为类似三角形的不规则形状。同样也能够看到已经死亡的神经细胞(见图3),其表现为膨胀变圆,在活性较差的脑片中此类细胞数量较多。

图1 海马细胞层

图2 皮层区域的神经元

图3 皮层区域的死细胞

除神经细胞外,脑中的胶质细胞,例如星形胶质细胞等不能清楚地看到。但在某些位置可以看到细长的管状结构,其中还有两面凹的圆饼状细胞,提示该结构可能是脑内的微血管(见图4)。

图4 疑似的微血管结构

5 教学经验

脑片实验所需准备的物品较多而零散,充氧需要提前至少1 h进行,制作解剖液冰块需要提前1 d。由于进行实验的学生较多,因此切片机、孵育脑片的容器数量也较多,每组切片浴槽液、孵育液等要分别充氧饱和。这些都要求教师在课前进行细致的准备,摆放条理整齐,才能保证实验顺利进行。

由于神经元对于缺氧缺血非常敏感,取脑后到将切下的脑片放入孵育液的时间间隔越短越好,因此脑片实验需要操作者对整个流程有全局的掌握和充分的准备,同时对熟练度有较高要求。教师在课前发放讲义,在示教过程中介绍详细的操作步骤和注意事项,指出脑组织操作的时间特殊性,强调要对全程操作的步骤心中有数方可实施,同组实验者要做好配合,切忌匆忙上手,做一步考虑一步。

学生在实验课上是初次操作,很难做到快速、准确地完成,因此学生制备的脑片活性可能并不理想。对此应向学生明确实验目的主要是了解制备过程并实际动手尝试,避免学生由于无法在课上制备活性较好的脑片而产生挫败感。此外,脑片制备的难度适中,在实际教学中,绝大多数学生的脑片中都能够找到存活的神经元,可以进行后续的观察,获得所需的结果。

学生操作过程中除了不熟练导致速度较慢以外,最大的失败因素是切片时脑固定不牢,切片厚度不稳定,甚至造成脑切块与脑片台脱离,而无法进行切片。国产切片机KD-400型配备的脑片台为不锈钢材质,与脑切块的黏合性很差,因此在实际使用中另行设计制作了塑料材质的脑片台,固定和切片成功率得到了提高。但塑料材质的问题是如不及时清理残余的502胶水,后期将很难刮除,最终造成脑片台无法使用。为此,目前教学条件下实验前要求学生切片结束及时清理,避免长期积存无法清理,影响使用。后续将参考其他切片机寻找更合适的材料制作脑片台。

6 后续实验设计

脑片制备是神经生物学的基本技术,在此基础上可以开展多种实验。实验处理可以在切片前对活体动物操作,或者在切片后对离体脑片施加。例如对动物进行缺血处理后,制备脑片观察其中神经元的死亡情况[1]；也可以在动物发生惊厥[2]或经低氧预处理[3]后研究其电生理学等性质的变化。利用离体脑片可以建立多种损伤模型,例如氧糖剥夺模拟的缺血模型[4]。建立这类模型后进一步研究神经元电生理学特性[5]或者蛋白质修饰[6]等方面的现象。脑片也可以进行长时间培养,从而研究各种药物和处理的慢性作[7-8]。

脑片的主要用途是进行电生理学记录及光学成像等。厚度在300～400 μm范围内的脑片是进行电生理学记录的重要材料[9],特别是在突触可塑性的研究中[10],能够充分发挥脑片保持了完整神经联系的优点,这在一些药理学研究中也有着重要的应用[11]。振动切片机也可以制备较薄的脑片,厚度在100 μm左右,这种厚度的脑片可以进行尼式染色等标记进行光学观察,用于神经元存活及形态等方面的研究。使用荧光染料及荧光显微镜等设备,根据染料的不同,可以观察并记录脑片内的神经元、树突脊等形态和钙信号等现象[12-13]。

虽然在脑片上可以完成的科学实验种类很多,但是通常都需要大型设备,例如膜片钳系统、荧光显微镜或双光子显微镜等。另外膜片钳记录等实验操作复杂,比较难以在本科生实验教学中开展。可以考虑在脑片制备实验的基础上,进一步选修一些高级实验,例如电生理学记录或荧光成像观察等,丰富教学体系。

7 结语

基础实验的教学工作除了通过经典实验提高学生对理论知识的理解,还需要与时俱进,跟上科学前沿的发展。在科研工作飞速发展的背景下,生理学实验教学与科研方法的距离越来越远,对于教学工作也造成了很大的困扰。为了提高教学质量和学习兴趣,必须不断改革实验内容,这样才能在本科教育中继续发挥作用。离体脑片制备及观察实验的开展,是一个有益的尝试,并且也取得了较好的反馈,因此将继续进行探索,增加参加实验的人数并扩展实验内容。

致谢:感谢柴真教授在讲授生理学理论课的同时指导我们开展教学和实验改革,对生理学实验课的建设和发展提供了重要的支持。

References)

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[3] 赵彤,于顺,丁爱石,等.低氧预适应增强大鼠海马神经元的耐缺氧能力[J].生理学报,2001(1):72-74.

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Practice on preparation of rat brain slices and its observation experiment in physiological experimental teaching

Zhou Chen1, Gao Shan1,2, Wei Jun1, Bi Qun1

(1. National Experimental Teaching Demonstration Center for Biology,School of Life Science,Peking University, Beijing 100871,China; 2. Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)

Acute brain slices are important materials in the neuroscience studies. The experiment of the preparation of the acute brain slices is helpful to contact the scientific frontier,increase the interest in learning and improve the teaching quality. From 2013,the Physiological Experiment course group at Peking University tried to select the experimental part to carry out the preparation and observation of rat brain slices. So far,112 students have completed the experiment,and the good feedback is achieved. The accumulated teaching experience provides a good basis for the further development of brain slice related experiments,and also provides the idea and direction for the teaching reform.

physiological experiment; acute brain slice; vibration slicing

10.16791/j.cnki.sjg.2017.07.045

2017-01-10

国家自然科学基金基础科学人才培养基金项目(J1310033)

周辰(1975—),男,江苏无锡,博士,工程师,研究方向为神经生物学和电生理学.

E-mail：zezhou@sina.com

G642.0; Q4-33

A

1002-4956(2017)07-0174-04