德美羊与中美羊胎儿期骨骼肌组织学结构发育特征差异性研究

李雪娇，刘晨曦，杨开伦，刘明军*

（1.新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐830000；2.新疆畜牧科学院生物技术研究所，新疆 乌鲁木齐830000）

畜牧科学

德美羊与中美羊胎儿期骨骼肌组织学结构发育特征差异性研究

李雪娇1，2，刘晨曦2，杨开伦1，刘明军2*

（1.新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐830000；2.新疆畜牧科学院生物技术研究所，新疆 乌鲁木齐830000）

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.04.001

【目的】德美羊产肉性能优于中美羊，为了揭示绵羊产肉性能差异机制，本试验研究德美羊和中美羊胚胎期骨骼肌组织学结构特征发育及其差异性。【方法】选择妊娠期骨骼肌发育关键阶（75D、105D和135D），取德美羊与中美羊胎儿，记录体尺数据，采集背最长肌，进行石蜡包埋和组织切片，统计德美羊与中美羊不同发育阶段胎儿单位肌纤维数量、直径和密度。【结果】D75时德美羊肌肉发生活动滞后于中美羊，德美胎羊肌纤维数量在D105阶段达到峰值，至D135时，德美羊肌纤维致密性明显好于中美羊，肌纤维呈紧密、均匀排列。D75和D135时德美羊和中美羊单位面积肌纤维数量差异极显著（P＜0.01）。而肌纤维直径变化与体尺生长数据呈正相关，D105和D135德美羊和中美羊单位面积肌纤维直径差异极显著（P＜0.01）。【结论】本试验探究了德美羊与中美羊胎儿骨骼肌中后期的组织学发育模式，发现了D105是肌纤维从肌增生到肌肥大发育的关键时间窗口，且德美羊与中美羊发育模型存在差异，这种差异或是造成产肉性能差异的重要原因之一。

胎儿期；骨骼肌；组织学结构

新疆土地辽阔，得天独厚的牧草资源和畜种资源为新疆养羊业的迅猛发展奠定了坚实的基础，绵羊一直以来都是新疆畜牧业的主要畜种[1]。羊肉的营养价值丰富，是人们日常生活中不可或缺的营养来源之一[2]。随着新疆畜牧业的飞速发展，越来越多的人开始追求高品质羊肉。影响肉品质的原因很多，骨骼肌肌纤维的组织学结构特征是决定肉品质的关键因素之一[3,4]。胎儿期肌纤维的数量和直径影响着骨骼肌终生的生长发育，且肌纤维组成类型和比例也在胎儿期基本形成，胎儿期也是决定家畜产肉性能的关键时期。目前关于胎儿期骨骼肌肌纤维发育的相关研究多以小鼠和猪为主[5,6]，反刍动物较少。胎儿期肌纤维生长发育能力影响或决定着绵羊的产肉性能，因此弄清绵羊胎儿期骨骼肌肌纤维组织学发育性特征，对绵羊产肉和肉品质性能的提高具有重要的科学意义。

中国美利奴羊主要是以澳洲美利奴羊为父本，与波尔华斯羊和当地新疆细毛羊通过级近杂交，于1985年在新疆的巩乃斯种羊场培育而成[7]，是我国优良的细毛羊品种。该品种具有毛品质好、产毛量高、适应性强[8]，体格较大，四肢结实等特征，中国美利奴羊虽不是专门的肉用品种，但其综合经济效益可同专门化肉用羊相媲美。德国美利奴羊是由泊力考斯和英国莱斯特公羊与原产德国的美利奴羊杂交培育而成[9]，具有早熟、生长发育快、繁殖率高、被毛品质优以及产肉性能好等[10]特点。国内研究表明，在同等饲喂环境下，中美羊单羔平均初生重为3.92 kg，德美羊初生重约4.17 kg，两者相差不大。中美羊3月龄断奶重20.16 kg，德美羊重25.78 kg，此时这两个品种已拉开差距；到周岁德美羊平均体重可达58.67 kg，比周岁中美羊的45.38kg重13.29kg；6月龄德美羊的净肉率达36.29%，比中美羊的31.87%超出4.42%，说明德美羊产肉性能显著高于中国美利奴羊[11]。

家畜生长发育的关键阶段是在胎儿期，胎儿期的生长决定着家畜出生后早期甚至成年后生长发育的表型性状[12]。胎儿期或是决定着绵羊产肉性能形成的关键时期，并且此阶段肌纤维生长发育能力或决定其终生的产肉性能。因此，弄清胎儿期肌纤维发育的组织和细胞学特征及其差异，是揭示绵羊产肉性能差异机制的重要基础。德美羊产肉性能优于中美羊，鉴于目前对绵羊产肉性能差异机制的认识尚不全面，而胎儿期骨骼肌的生长发育能力很有可能影响其产肉性状，本试验对比德美羊和中美羊胎儿不同发育阶段骨骼肌纤维直径、数量及密度变化等组织学结构研究以及免疫组化分析结果，探究德美羊和中美羊胚胎期骨骼肌组织学生长发育的差异，是揭示绵羊产肉性能差异机制的基础，同时也为提升家畜产肉性能的技术方面提供可靠的参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择年龄相近、体况良好、体重在55～60 kg的成年德国美利奴母羊（购自新疆巴州种畜场）和中国美利奴羊，经过埋栓同期发情处理后进行人工授精配种，通过超数排卵获得胚胎并移植到身体状况相同的受体母羊，怀孕母羊均按照国家农业行业标准（NY/T816-2004）肉羊饲养标准，根据母羊体重定时、定量饲喂，其后代为试验动物。采样时间分别为怀孕母羊妊娠的第75 d（D75）、第105 d（D105）和第135 d（D135），每组采样个体为3只。

1.2 主要试剂

无水乙醇购自天津市致远化学试剂有限公司，二甲苯购自天津永晟精细化工有限公司，快肌抗体(M4276，SIGMA)和慢肌抗体（M8421，SIGMA）购自Sigma公司，伊红染液（水溶性）和苏木素染液（Harris）购自（台资）珠海贝索生物技术有限公司，DAB染色液（链霉菌-生物素法）免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 样品采集及处理

分别于母羊妊娠的D75、D105、D135对怀孕母羊进行剖腹产，屠宰时尽量避免对妊娠母羊的挤压，使其充分放血后剖皮，沿腹中线开膛取出腹中胎儿，迅速采集3只胎羊的骨骼肌组织（背最长肌），所有试验动物取材部位相同，置于苦味酸固定液中。同时记录试验动物羊号，测量胎羊体长、体高、体重等数据。将试验组织进行常规的石蜡包埋[13,14]。

1.4 H.E.染色法

将石蜡包埋好的样品按照6μm厚度进行切片，于65℃烘箱中烘烤2～3 h，冷却至室温，用H.E.染色法[15-17]进行染色，具体步骤如下：二甲苯浸泡15min→二甲苯浸泡10min→100%乙醇：二甲苯（1：1）浸泡3～5min→100%乙醇3min→95%乙醇3min→80%乙醇3min→70%乙醇3min→50%乙醇3min→苏木素溶液染色8～10min→自来水冲洗3～5min→0.5%盐酸酒精水分色蓝化3～5s→自来水冲洗3～5min→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇各浸泡3min→0.5%伊红溶液染色2min→95%乙醇3min→95%乙醇3min→100%乙醇3min→100%乙醇3min→100%乙醇：二甲苯（1：1）3min→二甲苯5min→二甲苯5min→中性树胶封片。

1.5 分析方法

用Olympus DP2-BSW图像采集系统取10×40倍放大的图像，每个样本取6～8张切片进行分析，每个样品选取不重复、不缺失的10个视野。用图像分析软件（Imgae）进行数据的测量，统计单位面积肌纤维的数量、直径和单位面积。肌纤维数量为每个视野面积内单根肌纤维总数量的平均值，肌纤维直径为每个视野面积内肌纤维直径的平均值。肌纤维密度值为每个视野中肌纤维数量肌纤维数量除以视野面积所得的平均值。用图像分析软件统计视野面积快肌和慢肌数量。所测量数据用SPSS统计方法处理，统计结果以平均值±标准差（Mean±STD）表示，同时对所得试验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 德美羊和中美羊胎羊体尺变化规律对比

表1显示德美羊与中美羊胎儿体尺数据，从D75至D135时期德美羊与中美羊胎儿各项体尺指标均呈逐渐增长的趋势。随着怀孕母羊妊娠天数的增加，胎羊体重逐渐增加、体长和体高也相应增长。从D75至D135时期中美羊和德美羊胎儿体重均呈近18倍增长，体长呈2.7倍增长、体高呈近3倍增长。相较中美羊而言，德美羊不同发育阶段胎羊体重普遍高于中美羊，体长稍小于中美羊胎儿，各时期体高发育状况与中美羊差异不大。

表1 德美羊和中美羊胎儿期体尺数据Table 1 The date of German and Chinese Merino sheep fetal body size

2.2 德美羊和中美羊组织学结构特征变化规律对比

德美羊和中美羊胎儿背最长肌组织切片经H.E.染色后结果如图1所示，中国美利奴羊和德国美利奴羊在D75时期胎儿骨骼肌均可见中空管状的初级肌纤维典型结构，且在初级肌纤维四周，围绕着大量的次级肌纤维，从图片可以看出，德美羊胎儿D75时胎儿肌纤维数量少于中美羊，说明此时德美羊肌肉发生活动滞后于中美羊。中美羊和德美羊于D105和D135胎儿骨骼肌切片未见初级肌纤维结构特征，均呈现了次级肌纤维结构。表明在D75时期后，初级肌纤维与次级肌纤维发生融合，肌纤维的形成已经完成。在D105时期中美羊与德美羊肌纤维数量基本恒定。到D135时，中美羊和德美羊肌纤维的发育均表现为肌纤维面积不同程度的增大，肌纤维直径显著增粗，且德美羊胎儿肌间脂肪含量逐渐降低，肌纤维排列较为紧密、均匀，肌纤维致密性好于中美羊胎儿。

图1 德美羊和中美羊胎儿期不同发育时期背最长肌H.E.染色法切片对比图Fig.1 The comparison of German and Chinese Merino sheep fetus at different developmental stages of longissimus muscle H.E.staining slice

统计中美羊和德美羊背最长肌组织单位面积肌纤维数量和肌纤维直径等数据，结果如表2所示，德美羊在D75时期胎儿单位肌纤维数量较少（310.23±77.15），与中美羊相比，D75时期德美羊胎儿单位面积肌纤维数量少于中美羊，D105时德美羊胎儿单位肌纤维数量达到最大（369.41±72.64），从D75至D105时期德美羊胎儿单位面积肌纤维数量显著增加，从D105至D135胎儿单位面积肌纤维数量逐渐减少，D105和D135时期德美羊胎儿单位面积肌纤维数量多于中美羊、直径小于中美羊。从D75至D135时期中美羊与德美羊胎儿单位面积肌纤维直径均呈现逐渐增加的趋势。D75和D135时德美羊和中美羊单位面积肌纤维数量差异极显著（P＜0.01），D105和D135德美羊和中美羊单位面积肌纤维直径差异极显著（P＜0.01）。肌纤维密度与肌纤维数量变化规律类同，均呈现先高后低的变化趋势。

表2 德美羊和中美羊胎儿期单位面积肌纤维数量、直径对比Table 2The statistical results of quantity and diameter of muscle fiber of German and Chinese Merino sheep fetal unit area

图2反应德美羊和中美羊胎儿期单位面积肌纤维数量和直径变化的差异。德美羊单位面积肌纤维数量变化总体均呈现先升后降的趋势，而中美羊单位面积肌纤维数量逐渐降低。德美羊胎儿单位面积肌纤维数量在D105时单位面积肌纤维数量出现拐点，此时期单位面积肌纤维数量达到最高值，从D105至D135单位面积肌纤维数量逐渐降低。D75时期德美羊胎儿单位面积肌纤维数量低于中美羊，胎儿发育后期德美羊胎儿单位面积肌纤维数量高于中美羊。中美羊和德美羊胎儿单位面积肌纤维直径均随妊娠天数的增加而逐渐增加，D75时期德美羊胎儿单位面积肌纤维直径大于中美羊，发育后期德美羊单位面积肌纤维直径显著小于中美羊。

图2 中美羊和德美羊胎儿期单位面积肌纤维数量、直径变化趋势Fig 2 The trend chart of the quantity and diameter of muscle fiber of Chinese Merino and German Merino sheep fetal unit area

3 讨论

近年来，国内外研究学者相继开展了绵羊胎儿期不同发育阶段骨骼肌生长发育、肌肉组织基因表达以及母体营养限制对胎儿生长发育影响的研究。本研究主要比较德美羊和中美羊这两个不同品种绵羊胎儿期不同发育阶段骨骼肌组织学结构特征的差异性。结果显示，德美羊胎儿早期肌肉发生活动滞后于中美羊，而后期妊娠天数达D135时，德美羊肌纤维致密性明显好于中美羊，肌间脂肪含量较低，肌纤维呈紧密、均匀排列。德美羊胎儿肌纤维数量在D105阶段达到峰值，骨骼肌在中期发育中主要以肌纤维数量的增加为主，到D105左右肌纤维数量基本恒定，而胎儿骨骼肌后期发育主要以肌纤维面积的增大为主。胎儿总的肌纤维数量变化趋势呈现先增加后减少，而肌纤维直径随着发育阶段的推移而逐渐增加，且肌纤维直径变化与胎儿表型生长或胴体发育呈现出一定的正相关性。德美羊胎儿肌纤维发育模型基本上与其他报道的一致，但D105胎龄时其发育特征与中美羊的不同。这种发育模型上的差异有可能是造成产肉性能高低的原因。

综上所述，本试验比较了德美羊和中美羊胎儿骨骼肌中后期的组织学发育模式，确定了D105是绵羊肌纤维从肌增生到肌肥大的关键时间窗口，且发现德美羊胎儿早期肌肉发育状况较为滞后，而后期肌纤维致密性较好。本研究为进一步探究绵羊胎儿骨骼肌发生机制奠定了基础，并为提高绵羊产肉和肉品质性能提供了理论依据。

[1]蒋小怀.新疆养羊业生产形势分析与发展对策研究[J].草食家畜,2014,（2）：1-5.

[2]赵有璋.羊生产学[M].北京：中国农业出版社,1993.

[3]周金星,毕亚玲,高登惠.肌肉组织学结构及其与肉品品质的关系[J].山地农业生物学报,2004,23(5)：438-441.

[4]赵晓,莫德林,张悦,等.猪的骨骼肌生长发育研究进展[J].生命科学,2011,23(1)：37-44.

[5]刘居鹏,单安山,彭济昌.猪肌纤维发育及其与肉质的关系[J].中国饲料,2006,（16）：11-12.

[6]郭云雁,王立贤,程笃学,等.猪肌纤维组织学特性研究进展[J].中国畜牧兽医,2007,34(8)：49-52.

[7]李志农.中国养羊学[M].北京：中国农业出版社,1993.

[8]张亚君,赵文生.中国美利奴羊(新疆型)产毛量的通径分析[J].草食家畜,2000,（03）：14-15.

[9]陈晓涛,章焕然,陈伟德.德国美利奴羊在新疆的应用前景[J].草食家畜,2003,（1）：9-10.

[10]闫江林,陈明辉,代江生,等.德国美利奴羊生长发育与繁殖特性的观察[J].草食家畜,2008,（01）：28-31.

[11]蒋烈戈,李勇忠,景亚平,等.德国美利奴羊与中国美利奴羊主要生产性能比较[J].中国草食动物科学，2013，(06)：78-79.

[12]刘瑞凿,刘真,吴明明,等.绵羊胚胎发育中后期骨骼肌BTG2/3的表达动态及其与Myostatin的关系[J].畜牧兽医学报,2015,(11)：1916-1923.

[13]陈璐,马恒辉,金邦茎.骨骼肌组织石蜡制片技术的改进[J].临床与试验病理学杂志,2008,24(2)：233-234.

[14]吴民华,柯湛华.石蜡制片术中切片过程的常见问题及解决方法[J].海南医学院学报,2006,12(3)：255-257.

[15]宋平,张世华,杨淑云.HE染色切片染色质量差的原因及处理方法[J].诊断病理学杂志,1995,2(1)：52.

[16]高铭都,黄义禄.病例组织切片技术[M].日本：南山堂出版社,1988：54-62.

[17]刘增辉.病理染色技术[M].北京：人民卫生出版社,2001：14.

[18]吴秉铨,刘彦仿.免疫组化学病理诊断[M].北京：北京科学技术出版社,2007.3.

[19]任占平.应用SP免疫组化染色法的体会[J].诊断病例学杂志,1994,1(3)：176.

[20]杨飞云,陈代文,黄金秀,等.猪背最长肌肌纤维类型的发育性变化及品种与营养影响特点[J].畜牧兽医学报,2008,39(12)：1701-1708.

Study on Differentiation of Fetal Skeletal Muscle Development Characteristics between German and Chinese Merino Sheep

LI Xue-jiao1,2,LIU Chen-xi2,YANG Kai-lun1,LIU Ming-jun2*
（1.College of Animal Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830000，China；2.Animal Biotechnological Research Center,Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000，China）

【Objective】This study is to clarify the formation and development pattern of muscle fiber and reveal the developmental characteristics of skeletal muscle tissue in fetal period of German Merino sheep.【Method】This study selecting the critical pregnancy(75D,105D and 135D)stage of fetal development measured fetal body size and took samples of fetal longissimus muscle to perform histological analysis by tissue paraffin embedded method and H.E staining.The body size of German Merino fetal sheep was measured.Longissimus muscle tissue from fetal sheep was performed the histology sections and H.E.staining to count for the fiber number,diameter and density at different developmental stages of fetal muscle tissue.Fiber type was determined using Immunohistochemistry to clarify the number and proportion of the primary/secondary and fast/slow muscle fiber type.【Results】With the pregnant period from D75 to D135,the increase of fetal weight was nearly 20 times,the body length and height is nearly 2.5 times.The numbers of muscle fibers in unit area gradually increased to D105 with inflection point,and the overall trend first climbed up and then declined.The growth rate of diameter of muscle fibers from D75 to D105 was relatively smooth,but that of D105-D135 become significantly larger.The change of muscle fiber diameter was positively correlated with body length development.In middle stage,the slow muscle(type I muscle fiber)was the main type,and the latter was mainly composed of fast muscle(type II muscle fiber).【Conclusion】This study clarified the development model of German sheep fetal skeletal muscle tissue 0during the middle and late pregnancy.We found that the pregnant time of 105 days was a critical time window with fiber developmental transformation from muscle hyperplasia to muscle hypertrophy,and made clear the slow muscle(type I muscle fiber)was the main type during middle stage,and the latter stage was mainly composed of fast muscle(type II muscle fiber). This study laid a foundation for further study on the mechanism of fetal skeletal muscle development,and provided a theoretical basis for improving the meat and meat quality of sheep.

Fetus;skeletal muscle;histological structure

S813.3

A

1003-6377（2017）04-0001-06

国家自然科学基金项目（31560627，U1503285）

李雪娇（1992-），女，新疆乌鲁木齐人，在读硕士，主要从事动物分子生物学研究。E-mail：825536679@qq.com

刘明军（1965-），男，新疆奎屯人，研究员，博士生导师，主要从事动物分子生物学研究。E-mail：xjlmj2004@yahoo.com.cn

2017-04-16，

2017-04-28