包装饮用水中铜绿假单胞菌定性检验盲样考核的结果与分析

□ 雷兰兰 郭玉凡 舒 静 郑玉红 严 烨 陕西省产品质量监督检验研究院

包装饮用水中铜绿假单胞菌定性检验盲样考核的结果与分析

□ 雷兰兰 郭玉凡 舒 静 郑玉红 严 烨 陕西省产品质量监督检验研究院

作为包装饮用水中铜绿假单胞菌检验资质的国家食品安全抽检监测承检机构，本实验室参加2016年食药总局食品安全抽检监测承检机构铜绿假单胞菌定性检验盲样考核。按照盲样考核作业指导书和《GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法》的要求检验，并结合全自动微生物生化鉴定系统（VITEK 2）对分离出的可疑菌落鉴定。结果显示，样品1559、1562、1565、1580、1582检出铜绿假单胞菌，1546、1573、1574、1579、1584未检出铜绿假单胞菌。

包装饮用水；铜绿假单胞菌；盲样考核

铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）原称绿脓杆菌，是一种常见的革兰氏阴性杆菌，为专性需氧菌，生长温度范围25～42 ℃。因对营养要求不高，所以在水、土壤、食品以及医院等环境中广泛存在[1]。随着消费增长饮用水中铜绿假单胞菌的污染问题逐渐呈现出来，国内众多研究者对包装饮用水中铜绿假单胞菌污染调查，发现饮用水中铜绿假单胞菌检出率多集中在3.2%～26.0%[2]。鉴于铜绿假单胞菌的致病性及其在成品水中较高的检出率，我国最新饮用水标准 GB19298-2014《包装饮用水》明确规定同一批次5份水样，每份每250 mL水样中铜绿假单胞菌不得检出。如果检出，则为不合格产品。因此，铜绿假单胞菌的检测也是食品安全检测中的非常重要的一项检测。本次考核，共收到编码不同的10组样品，采用国标方法检测，具体检测过程及结果分析总结如下。

1 设备材料与方法

1.1 待检样品

本次盲样考核任务来自国家食药总局，具体活动由中国食品药品检定研究院负责实施。收到的样品共计20件，分别为10瓶250 mL密封包装的水和10个装有冻干菌球的西林瓶，其中一瓶水对应一个西林瓶为1组样品，10组样品编码完全对应。编码分别为1546、1559、1562、1565、1573、1574、1579、1580、1582、1584。

1.2 实验方法

1.2.1 实验方法

参照GB 8538-2008中的铜绿假单胞菌的检测方法定性检验。

1.2.2 样品处理

样品处理参照随样品一起提供的作业指导书。在生物安全室中打开10瓶水及10个西林瓶，将10个西林瓶中的白色冻干菌球转移至10个对应编码的水瓶内，充分混匀成10个待检水样。

1.2.3 实验步骤

1.2.3.1 水样过滤及培养

固定好滤膜及滤器，将10个待检水样分别通过孔径0.45 μm的滤膜过滤，将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上。将10个平板置于（36±1）℃培养48 h。

1.2.3.2 分离培养

在培养48 h后，从每个滤膜上选取各类单菌落1～2个划线接种于营养琼脂培养基上纯培养。（36±1）℃培养24 h后续确证实验。

1.2.3.3 VITEK 2.0生化鉴定

从营养琼脂平板上挑取适量菌，制成比浊度在0.6～0.8的菌悬液VITEK 2.0生化鉴定。

1.2.3.4 氧化酶实验

从营养琼脂平板上挑取适量菌涂抹至氧化酶试纸上做氧化酶实验。

1.2.3.5 乙酰胺实验

从营养琼脂平板上挑取适量菌分别接种至乙酰胺肉汤中，（36±1）℃培养24 h时，向每支培养物中加入2滴钠氏试剂。

1.2.3.6 金氏B实验

从营养琼脂平板上挑取适量菌分别接种至金氏B培养基上，（36±1）℃培养一定时间后，在波长365 nm紫外灯观察其产荧光情况。

2 实验结果

2.1 CN琼脂平板上的菌落观察

CN琼脂平板上的菌落见图1、图2、图3和图4。

图1 有蓝绿色菌落生长的CN琼脂平板图

如图1和图2所示，编码1 559、1 562、1 565、1 580、1 582：有蓝绿色圆形菌落，菌落直径1～3 mm，表面湿润光滑，边缘整齐，在紫外灯下检查时有蓝绿色荧光产生。

图2 在紫外灯下检查有蓝绿色菌落生长的滤膜图

图3 无蓝绿色菌落生长的CN琼脂平板图

图4 在紫外灯下检查无蓝绿色菌落生长的滤膜图

如图3和图4所示，编码1 546、1 584：仅有浅黄褐色圆形菌落，菌落直径2～3 mm，表面光滑，边缘整齐，在紫外灯下检查时有荧光产生。编码1 573、1 574、1 579：占多数的一种为浅黄褐色圆形菌落，菌落直径2～3 mm，湿润光滑，边缘整齐，在紫外灯下检查时有蓝绿色荧光产生。占少数的一种为浅黄褐色圆形菌落，菌落直径不到1 mm，湿润光滑，边缘整齐，在紫外灯下检查时无荧光产生。

2.2 VITEK 2.0生化反应鉴定结果

编码为1 559、1 562、1 565-1、1 565-2、1 580、1 582的生化反应结果如表1所示，均为：Pseudomonas aeruginosa，置信度均为Excellent identification。

编码为1546-19、1546-20、1573-18、1574-15、1579-11、1584-13、1584-14的鉴定结果均为：Pseudomonas putida

编码为1574-16、1573-17的鉴定结果均为：Burkholderia cepacia group

编码为1579-12的鉴定结果为：Acinetobacter baumannii complex

2.3 氧化酶实验

如图5所示，编码为1559、1562、1565-1、1565-2、1580、1582、1 546-19、1546-20、1573-17、1573-18、1574-15、1574-16、1579-11、1579-12、1584-13、1584-14及阳性对照9027均显示深紫色。阴性对照8739未显示紫色。

图5 氧化酶实验结果图

2.4 乙酰胺实验

在培养24 h后的乙酰胺肉汤中滴加钠氏试剂，反应结果如图6、7所示，

编码为1559、1562、1565-1、1565-2、1580、1582及阳性对照9027的培养物均出现明显的砖红色。

编码为1546-19、1546-20、1573-17、1573-18、1574-15、1574-16、1 579-11、1579-12、1584-13、1584-14及阴性对照8739的培养物均未产生砖红色。

2.5 金氏B培养基实验

在紫外灯下观察产荧光状况如图8所示，编码为1559、1562、1565-1、1565-2、1580、1582、1546-19、1546-20、1573-17、1573-18、1574-15、1574-16、1579-11、1579-12、1584-13、1584-14及阳性对照9 027均有荧光产生。阴性对照8739未产生荧光。

表1 铜绿假单胞菌的VITEK生化反应鉴定表

图6 乙酰胺肉汤24h培养物滴加钠氏试剂前图

图 7乙酰胺肉汤24h培养物，滴加钠氏试剂后图

图8 金氏B培养基，培养24h，紫外灯下观察图

3 结论

综合形态学和生化鉴定，得出本次样品检测结果。检出铜绿假单胞菌的样品为：1559、1562、1565、1580、1582；未检出铜绿假单胞菌的样品为：1546、1573、1574、1579、1584其中的干扰菌大部分是恶臭假单胞菌，另有少量干扰菌是洋葱伯克霍尔德菌群和鲍氏不动杆菌复合体。结果上报本次盲样考核实施机构，实施机构对我院本次提交的盲样考核结果反馈为满意，说明我院有能力检验饮用水中铜绿假单胞菌。

[1]徐励琴,薛计泉,罗泽燕,等.桶装饮用水铜绿假单胞菌检测及耐药性分析[J].海峡预防医学杂志,2015,21(3):56-57.

[2]杨娟,蔡震,徐妍.泰州市桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染监测[J].中国卫生检验杂志,2016,26(12):1771-1772.