甘肃省苹果炭疽病病原鉴定及ITS序列分析

马永强

摘要：果实炭疽病是苹果生产中常见的重要病害之一。通过形态特征结合病原菌的内部转录间隔区（internal transcribed spacer sequence，简称ITS）区域比对分析，确定引起甘肃苹果果实炭疽病的病原为胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）。

关键词：甘肃省；苹果炭疽病；胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）；ITS序列分析

中图分类号： S436.611.1+2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0089-02

果实炭疽病是苹果生产中普遍发生的重要病害，包括果实上的苦腐病（bitter rot of apple）和叶片上的叶枯病（glomerella leaf spot）[1]。典型的苹果炭疽病病菌通常仅危害果实，引起果实表面形成圆形病斑，后期产生呈同心轮纹状排列的小粒点，病部横切剖面呈圆锥形，果肉变褐腐烂，具苦味[2]。苹果炭疽病在世界上所有气候温暖湿润、适宜种植苹果的国家和地区都有发生，如美国、澳大利亚、英国、法国、德国、丹麦、保加利亚、荷兰、俄罗斯、巴西、墨西哥、日本、韩国等[3]。苹果果实炭疽病通常在果实近成熟时开始发病，采收后贮藏期间继续发展，造成采前大量落果和采后贮藏中发生果腐，病果率达30%左右，严重可达50%～60%，我国每年因炭疽病造成的果品采后损失为20%～30%，采后果实腐烂已是生产中的突出问题[4]。2013年笔者调查了甘肃省苹果主产区果实炭疽病的发病率，通常在0.8%～13.6%，属轻、中度发生。通过采样和室内分离鉴定，旨在明确病原菌的种类，为生产中科学制定防控策略提供依据。

1材料与方法

1.1病样标本采集及病原菌分离

2013年9月从甘肃省陇南市礼县永平乡、永兴乡、祁山乡、天水麦积区伯阳镇、清水县永清镇等苹果主产区采集炭疽病标样，苹果品种为红元帅。病原菌的分离采用常规组织分离法，对采集的标样进行分离纯培养后，将菌种保存在试管斜面上。[JP]

1.2致病性测定

致病性测定参照张荣等的方法[5]。选择有代表性的菌株，将供试菌株移于PDA（potato dextrose agar）培养基斜面上培养，7 d后用无菌水洗下分生孢子，配置成分生孢子悬浮液，浓度为1×105 个/mL。取健康的红元帅苹果，用自来水清洗表面，70%乙醇表面消毒，自然风干，将捆扎在一起的5根7号昆虫针于乙醇灯上烧灼消毒，冷却后，扎刺果实，形成深度2.5 cm 的伤口，用移液枪向伤口中注入20 μL孢子悬浮液，25 ℃恒温箱内保湿培养。对照用无菌水接种。每处理设3个重复。观察病记录接种结果。对接种发病的病斑再次进行组织分离。

1.3病原菌形态鉴定

选取具有代表性的菌株移植于PDA 平板上，置于25 ℃的恒温培养箱中培养，观察病原菌在PDA平板上的菌落特征、培养性状，7～10 d后，挑取分生孢子团，进行镜检，观察分生孢子的形态特征，并用显微测微尺测量分生孢子大小。

1.4病原菌ITS序列測定与分析

病原菌的DNA提取和核糖体rDNA的内部转录间隔区ITS区域的扩增与测序委托上海基康生物技术有限公司完成。

1.4.1DNA提取

病原菌DNA提取采用White等的方法[6]。[JP]

1.4.2核糖体rDNA ITS区域的扩增与测序

扩增所用引物为ITS区通用引物ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[7]。PCR反应体系总体积为25.0 μL：10×PCR 缓冲液2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板2.0 μL，超纯水14.3 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃复性30 s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。取 5 μL 反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪下检测PCR产物大小，DNA Marker DL 2000。用北京博大泰克生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒，扩增产物上样ABI3730DNA 测序仪检测，采用双脱氧测序法，测序引物为ITS1-F /ITS4，进行双向测序。

1.4.3病原菌rDNA ITS 序列分析

选择具有代表性的菌株，将所测得到菌株ITS的序列加入到NCBI（美国国家生物技术信息中心）网站，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTA”程序，与GenBank中海量的微生物序列进行比对，查找相似性较高的序列，并以FASTA的格式从GenBank下载。所有的序列用Clustal X（1.83）进行校排。校排结果用人工借助BioEdit 5.0.9.1进行修正。最后用序列分析软件MEGA 510进行最大简约法（maximum parsimony）分析，ITS序列构建系统树时重复1 000次得到最大简约树。

2结果与分析

2.1致病性测定

将分离纯化好的代表性菌株tj4927接种健康的红元帅苹果，3 d后，接种病菌的苹果开始发病，10 d后，症状表现明显，初发病时，果面上出现浅褐色、有清晰边沿的针头大的圆形小斑，以后逐渐扩大，病部色泽随之加深，并向下凹陷，苹果表面产生圆形的同心轮纹状病斑，其上产生黑色颗粒（分生孢子盘）（图1-A），切开后果实内呈漏斗状（图1-B），发病症状与田间一致；对照苹果果实未见发病。对接种发病的病斑再次进行病菌分离，结果表明，分离得到的病原菌与接种的病原菌培养性状一致，说明分离得到的病原菌为苹果炭疽病病原菌。

2.2病原菌形态鉴定

将菌株tj4927接种于PDA平板培养基上培养7 d 左右即长满培养皿，边缘整齐，浅灰色至鼠灰色，气生菌丝绒状，产生黑色的分生孢子堆，后期产生橘红色分生孢子团（图1-C）；分生孢子单胞、无色、椭圆形或圆筒形，两端钝圆，大小（11～20） μm×（3.0～4.5） μm（图1-D）。根据培养性状及分生孢子形态特征，菌株tj4927鉴定为胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）。

2.3病原菌ITS序列分析

以葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）种为外群，通过

[FK（W17][TPMYQ1.tif][FK）]

种间ITS序列构建系统树，如图2所示。通过系统树分析可知，4种不同种类炭疽菌与菌株tj4927、tj4953、tj4989、tj4967、tj4977、tj4963、tj4982和tj4979聚在同一分支上，且菌株tj4927、tj4953、tj4989、tj4967、tj4977、tj4963、tj4982和tj4979与已知菌AJ301919和AJ301988以100%的支持强度聚集在同一分支上，应为同一种，即胶孢刺盘孢（

3讨论

王晓鸣等最早将我国苹果炭疽病的病原鉴定为胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）[8]，此后一直认为我国苹果炭疽病的病原为胶孢炭疽菌，生产中防治也是针对这一种病原菌进行。Sutton首次提出尖孢刺盘孢（Colletotrichum acutatum）是引起苹果炭疽病的病原菌之一[9]，此后美国、日本、挪威等国均有研究表明，苹果炭疽病由C. gloeosporioides和C. acutatum 2种病原引起[10-13]。张荣等研究了陕、豫2省苹果炭疽病病原菌后发现，尖孢刺盘孢（C. acutatum）可引起苹果果实炭疽病[5]。符丹丹通过苹果炭疽病菌内转录间隔区序列（ITS）、肌动蛋白（ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，简称GAPDH）、几丁质酶（CHS-1）和β-微管蛋白2（TUB2）单基因及多基因联合的系统发育分析方法对辽宁、山东、河南和陕西等省苹果主产区苹果炭疽病进行鉴定，确定我国苹果炭疽病病原菌可分为7个分类单元，包括6个已知种、1个新种，其中引起果实苦腐病的病原菌有6个种，分别为异国刺盘孢（C. alienum）、果生刺盘孢（C. fructicola）、胶孢刺盘孢（C. gloeosporioides）、睡莲刺盘孢（C. nymphaeae）、暹罗刺盘孢（C. siamense）和新种-东方刺盘孢（C. orientalis），苹果炭疽叶枯病的病原分2个种，即隐秘刺盘孢（C. aenigma）和果生刺盘孢（C. Fructicola），说明苹果炭疽病病原菌复杂多样[1]。

本研究通过形态特征结合病原菌的内部转录间隔区ITS

区域比对分析，确定引起甘肃省苹果果实炭疽病的病原为胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides），有关甘肃省苹果炭疽病病原菌的多样性有待进一步研究。

参考文献：

[1]符丹丹. 中国苹果炭疽病病原菌的遗传多样性[D]. 杨凌：西北农林科技大学，2014.

[2]王薇，符丹丹，张荣，等. 苹果炭疽叶枯病病原学研究[J]. 菌物学报，2015，34（1）：13-25.

[3]González E，Sutton T B. Population diversity within isolates of Colletotrichum spp. causing Glomerella leaf spot and bitter rot of apple in three orchards in north Carolina[J]. Plant Disease，2004，88（12）：1335-1340.

[4]吳芳芳，檀根甲，陈仁虎. 苹果果实炭疽病的研究进展[J]. 安徽农业大学学报，2002，29（1）：29-33.

[5]张荣，王素芳，崔静秋，等. 陕、豫两省苹果炭疽病病原鉴定[J]. 中国农业科学，2009，42（9）：3224-3229.

[6]White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]. New York：Academic Press，1990：54-55.

[7]Gardes M，Bruns T D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts[J]. Molecular Ecology，1993，2（2）：113-118.

[8]王晓鸣，李建义. 陕西省炭疽菌的研究[J]. 真菌学报，1987，6（4）：211-218.[HJ1.7mm]

[9]Sutton B C. The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum[M]. Wallingford：Comminwealth Agricultural Bureau International，1992：112-114.

[10]Biggs A R. Effects of calcium salts on apple bitter rot caused by two Colletotrichum spp.[J]. Plant Disease，1999，83（11）：1001-1005.

[11]González E，Sutton T B，Correll J C. Clarification of the etiology of Glomerella leaf spot and bitter rot of apple caused by Colletotrichum spp. based on morphology and genetic，molecular，and pathogenicity tests[J]. Phytopathology，2006，96（9）：982-992.

[12]Chung W H，Ishii H，Nishimura K，et al. Fungicide sensitivity and phylogenetic relationship of anthracnose fungi isolated from various fruit crops in Japan[J]. Plant Disease，2006，90（4）：506-512.

[13]Guerber J C，Liu B，Correll J C，et al. Characterization of diversity in Colletotrichum acutatum sensu lato by sequence analysis of two gene introns，mtDNA and intron RFLPs，and mating compatibility[J]. Mycologia，2003，95（5）：872-895.

[FQ）]