三黄地榆散对多重耐药铜绿假单胞菌的抑制作用研究

张 涛，伍君锋，肖新云，邓江艳，李帅东，刘俊青，蔡 锐*

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

·方药研究·

三黄地榆散对多重耐药铜绿假单胞菌的抑制作用研究

张 涛，伍君锋，肖新云，邓江艳，李帅东，刘俊青，蔡 锐*

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

目的 探讨三黄地榆散对多重耐药铜绿假单胞菌的抑制效果，为其临床应用提供依据。方法 首先制备中药含药血清用于体外最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）测定。然后建立烫伤大鼠感染多重耐药铜绿假单胞菌模型，分别给予西药硫酸庆大霉素和中药三黄地榆散灌胃，正常组和模型组灌胃等容量的无菌生理盐水；在给药后的第3、7、10天检测血液中炎性细胞和炎性因子的水平。结果 体外抑菌实验显示，三黄地榆散含药血清与庆大霉素对多重耐药铜绿假单胞菌的MIC、MBC均为512 μg/mL。体内实验结果显示，与模型组比较均能显著下调大鼠血清WBC、IL-1β、TNF-α的水平（P<0.05）。结论 三黄地榆散能抑制多重耐药铜绿假单胞菌的生长，对多重耐药铜绿假单胞菌感染烫伤大鼠治疗具有较好的疗效，机制可能与调节IL-1β、TNF-α 水平有关。

三黄地榆散；多重耐药铜绿假单胞菌；庆大霉素；抑菌

铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）原称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，属于革兰氏阴性菌。由于激素、免疫抑制剂的长期应用，加上化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，可引起严重的甚至致死性的感染；手术后或某些治疗操作后（气管切开、留置导尿等）的病人也易罹患本菌感染，因此铜绿假单胞菌已成为医院内感染的重要病原菌之一，特别在灼伤和儿童重症监护室[1]。由于铜绿假单胞菌抗药性强，近年来多重耐药铜绿假单胞菌（MDRPA）感染日益增多,多重耐药和泛耐药菌株的检出率不断增高,耐药谱广泛,其发病率和病死率居高不下,可发生在人体任何部位和组织，常见于烫伤或者创伤部位,这为抗菌药物治疗带来极大挑战[2]。

中医药抗感染的历史经验表明，在中医理论指导下遣方用药，可以将抗菌与保护机体、调节免疫紊乱相结合，通过多途径、多环节、多靶点发挥作用，促进损伤的修复，稳定内环境，从而削弱和改善细菌及其毒素对机体的损害与免疫系统的破坏[3]。药理学研究亦表明中药具有较多的抑菌成分，抑菌作用的机制和功能也较为多重,可作用于细菌的不同部位和繁殖的不同阶段，对细菌的多个代谢环节发挥作用，甚至可以逆转细菌的耐药性[4]。但目前中药在烧伤理论研究上虽有所发展却仍显创新不足，缺乏中药药效和机制研究[5]。中药三黄地榆散由黄连、黄芩、黄柏、地榆、紫苏、冰片组成，具有清热燥湿、泄火解毒作用，研究表明其具有化腐生肌、抗菌、消炎、止痛，促进组织细胞、表皮细胞再生的功效，有广谱抗菌作用[6]。本文探讨三黄地榆散体内外对多重耐药铜绿假单胞菌的抑制作用，为拓展多重耐药菌感染的治疗提供参考。

1 材料

1.1 药物

三黄地榆散：黄连 9 g，黄柏 9 g，黄芩 9 g，地榆3 g，紫苏3 g，冰片1 g，饮片于湖南中医药大学第一附属医院药房购入。2次水煎浓缩，药物浓度为0.43 g/mL。硫酸庆大霉素颗粒（葵花药业集团得菲尔有限公司，批号15015103），用无菌蒸馏水溶解，最终配制为0.3 g/mL的溶液。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量200～240 g，购自湖南斯莱克斯景达实验动物有限公司。许可证号：SCXK(湘)2014-0002。

1.3 实验菌株

多重耐药铜绿假单胞菌临床痰分离1509211399号，由湖南中医药大学第一附属医院检验科鉴定提供。挑取单个菌落，接种于液体LB营养琼脂培养基中，37 ℃下 180 r／min 摇菌 5～6 h，使其在 600 nm波长下吸光度值达到 0.8～1.0。收集处于对数生长期的细菌悬液，以半径 4 cm，3 000 r／min离心20 min。弃去上清液，用生理盐水洗涤3次重新悬浮后置于4℃冰箱备用，用平板倍比稀释法确定每毫升中CFU 为 1×106。

1.4 主要试剂与仪器

营养琼脂粉（杭州天和微生物试剂有限公司），硫化钠（天津市风船化学试剂有限公司）。立式压力蒸汽灭菌器 （CLDZX-30KB上海申安医疗器械厂）。电热恒温培养箱中（上海新苗医疗器械治疗有限公司）；酶标仪（北京普朗新技术有限公司）；AC8洗板机（芬兰Thermo Labsystems）。 TG16W 离心机（国产）。GNP-9080型培养箱（国产）等均由湖南中医药大学动物实验中心提供。

2 方法

2.1 体外抑菌实验

2.1.1 三黄地榆散含药血清（简称三黄血清）制备 大鼠常规饲养1周，室温控制在18～22℃之间，自由饮食饮水，采血前禁食过夜。大鼠0.43 g/mL三黄地榆散浓缩液灌胃1.72 g/kg，上下午各1次，共7 d，最后1次灌胃后1 h麻醉大鼠，进行腹主动脉取血注入含EDTA的抗凝采血管，3 000 r/min离心10 min，无菌分离血清，56～60℃水浴 30 min，灭活，4℃保存备用。

2.1.2 体外抑菌各组最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）、抑菌圈直径测定 将庆大霉素溶液分别和空白血清、三黄血清1∶1混合。在24孔板中加入M-H肉汤培养基1 mL，再分别在每组的第1个孔加入三黄血清、庆大霉素溶液、庆大霉素+空白血清混合溶液、庆大霉素+三黄血清混合溶液1 mL。采用二倍稀释法将各孔依次对倍稀释，最终每个反应体系均为l mL。取实验菌悬液10 μL加入各孔中，37℃培养18～24 h，然后分别转种至含有M-H琼脂培养基的培养皿上。37℃培养18～24 h。

在无菌操作条件下，吸取菌悬液100 μL，用涂布棒均匀涂抹在冷却凝固的琼脂培养基上，将牛津杯轻放在培养基表面。分别取上述各组溶液200 μL加入牛津杯中，于37℃恒温培养箱培养24 h后取出，测量各培养皿中有效抑菌圈的直径(mm)，计算平均值。

2.2 体内抑菌实验

2.2.1 动物分组 SD大鼠40只，雌雄各半，随机分正常组、模型组、庆大霉素对照组、三黄地榆散组，共4组，每组各10只。除正常组外，其他三组均造模。

2.2.2 造模[7-8]大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，用硫化钠将大鼠背部皮肤脱毛。将恒温水浴锅温度调至80℃，并在上面放置自制的中间有直径为3 cm圆形洞的薄木板。将大鼠放置在木板上，背部脱毛的区域浸在圆形洞的水浴中烫8 s，形成直径3 cm的深Ⅱ度圆形烫伤区域。24 h后在烫伤区域接种0.1 mL含1×106CFU/mL多重耐药铜绿假单胞菌菌液，接种细菌后24 h进行HE染色观察创面炎症反应情况，分别在创面接种细菌后第3、7、10天，用无菌操作法取痂下组织，进行革兰染色及生化反应鉴定菌种，检测并计算痂下细菌含量，造模成功标准为痂下细菌定量达到1×105CFU／g。

2.2.3 干预 模型成功后，模型组即给予生理盐水灌胃 0.8 mL，西药组给予硫酸庆大霉素灌胃（0.12 g/kg,1 次/d）0.8 mL，中药组给予 0.43 g/mL 三黄地榆散浓缩液灌胃1.72 g/kg每日1次，共10 d，正常组大鼠常规饲养。

2.2.4 取材与指标检测 分别在给药治疗后的第3、7、10天从各组大鼠尾静脉采血1 mL。大鼠取血后立即送样检测血液中白细胞（WBC）总数、中性粒细胞（N）总数、淋巴细胞（L）总数、C 反应蛋白；第 10天处死时采血用ELISA法测定白介素-1（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。

2.3 数据处理

用SPSS 19.0软件处理数据，各分组所得计量数据采用“±s”表示，多样本均数满足正态分布及方差齐性者用F检验，两组间均数比较用q检验，否则用秩和检验。 P＜0.05 表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

3 结果与分析

3.1 体外抑菌各组MIC、MBC及抑菌直径测定

三黄地榆散含药血清MIC值为512 μg/mL，MBC值为 512 μg/mL，平均抑菌圈直径为 9.9 mm；庆大霉素 MIC 值为 512 μg/mL，MBC 值为 512 μg/mL，平均抑菌圈直径为10.8 mm，联合三黄地榆散含药血清后其MIC和MBC值均有所下降，其MIC值降至256 μg/mL,MBC 值为 256 μg/mL，平均抑菌圈直径为 13.4 mm。 见表 1。

表1体外抑菌各组对多重耐药铜绿假单胞菌的MIC、MBC值、平均抑菌圈直径

3.2 各干预组对多重耐药铜绿假单胞菌感染烫伤大鼠WBC水平的影响

各组大鼠在烫伤感染后，WBC水平升高明显。在第3天治疗组大鼠的WBC水平均高于正常组水平(P＜0.01)；在第7天模型组大鼠的WBC水平远高于正常水平(P＜0.01)，三黄地榆散组与庆大霉素对照组大鼠的WBC水平较模型组降低明显 (P＜0.01或P＜0.05)；第10天，三黄地榆散组与庆大霉素对照组只有1例超出正常范围，而模型组均高于正常范围（P＜0.01），三黄地榆散组、西药对照组与模型组相比，WBC 水平降低(P＜0.01 或 P＜0.05)，其值接近正常水平。见表2。

表2 各组大鼠各时间点血液WBC的变化 （±s，n=10，×109个/L）

表2 各组大鼠各时间点血液WBC的变化 （±s，n=10，×109个/L）

注: 与正常组比较:#P＜0.01；与模型组比较:*P＜0.05，**P＜0.01。

组别正常组模型组庆大霉素组三黄地榆散组FP 3 d 6.78±1.02 12.19±0.99#10.99±2.16#10.39±1.15#1.793 0.208 7 d 6.14±2.10 19.22±1.45#16.45±1.69#*13.53±1.61#**16.070 0.000 10 d 7.01±1.71 12.27±2.72#6.10±3.67**6.69±1.70*7.337 0.008

3.3 各干预组对多重耐药铜绿假单胞菌感染烫伤大鼠白介素-1（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）增殖水平的影响

三黄地榆散组与庆大霉素对照组IL-1β、TNF-α水平与正常组水平接近，均明显低于模型组，差异非常显著（P<0.01）。见表3。

表3各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平的变化（±s，n=10，pg/mL）

表3各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平的变化（±s，n=10，pg/mL）

注:与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

组别正常组模型组庆大霉素组三黄地榆散组FP IL-1β 49.75±3.21 74.48±3.09##62.66±8.69**55.34±5.81**19.91 0.000 TNF-α 240.10±10.34 288.87±11.59##236.43±36.02**222.68±23.10**18.63 0.000

4 讨论

烧烫伤主要是由于各种理化因素造成的体表甚至深部组织的损害，病情具有广泛性和多发性的特点。近年来在烧烫上的治疗上，中药和西药都有了长足的发展，中西医结合仍是目前临床治疗烧烫伤最重要手段之一。中医学认为热毒为烧烫伤的主要病因，热毒内痈、血败肉腐是其基本的病机，提出清热解毒、热者寒之为治疗烧烫伤的基本原则。而西医学主要是从病理生理学角度开展烧伤治疗，通过改善烧伤早期的液体复苏、感染控制、营养补给、对烧伤创面进行覆盖并及时给予康复治疗来控制病情[9-10]，其中很大一方面是从控制创面感染来考虑的，抗生素类药物的使用占有很大的比例。由于近年来抗生素的泛滥使用，使得烧烫伤感染的常见菌也不断发生改变，多重耐药铜绿假单胞菌感染的发病率急剧攀升，其耐药性和耐药水平也迅速增加。近年来,该菌的临床分离率不断增加,已成为临床上最重要的耐药菌之一[11]。

结合中西医在治疗烧烫伤各自的优势，本课题组成员查阅大量文献发现验方三黄地榆散在临床治疗烧烫伤中疗效显著[12]，故从体内外探讨三黄地榆散对多重耐药铜绿假单胞菌的抑制作用。

本课题体外抑菌实验结果显示三黄地榆散含药血清能有效抑制多重耐药铜绿假单胞菌的生长，与庆大霉素对多重耐药铜绿假单胞菌的MIC、MBC值相同，能提高抗菌素的抑菌率，增强其抑菌、杀菌作用。体内实验以烫伤大鼠感染多重耐药铜绿假单胞菌为模型，探讨三黄地榆散对烫伤大鼠感染多重耐药铜绿假单胞菌机体相关炎症细胞和炎症因子的影响，结果表明三黄地榆散显著下调WBC、IL-1β、TNF-α的水平来控制烫伤组织的炎症反应，促进烫伤组织的修复。综上所述，三黄地榆散能体内抑制多重耐药铜绿假单胞菌的生长，并对其感染烫伤大鼠具有较好疗效，为中医抗多重耐药菌感染药物的研发提供了思路，值得进一步研究，拓展临床防治烧烫伤感染多重耐药菌的手段与措施。

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（本文编辑 杨 瑛）

Study on Inhibitory Effects of Multidrug Resistant Pseudomonas aeruginosa by Sanhuang Diyu Powder

ZHANG Tao,WU Junfeng,XIAO Xinyun,DENG Jiangyan,LI Shuaidong,LIU Junqing,CAI Rui*（Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo investigate inhibitory effects of muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa by Sanhuang Diyu powder and provide the basis for its clinical application.MethodsTCM serum was used for antibacterial experiment in vitro of minimal inhibitory concentration (MIC)and minimum bactericidal concentration (MBC).The scald model rats infected by muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa were given with gentamicin sulphate and Sanhuang Diyu powder by gavage,respectively.Both the normal group and the model group were given with same volume sterile normal saline by gavage.At the first 3,7,10 days after delivery,neutrophils and inflammatory factors were determined.ResultsThe results of bacteriostasis experiment in vitro indicated that MIC and MBC of Sanhuang Diyu powder and gentamicin on muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa both were 512 μg/mL.The results of bacteriostasis experiment in vivo indicated that Sanhuang Diyu powder and gentamycin could significantly decrease the levels of serum WBC,IL-1β and TNF-α in model rats (P<0.05).Conclusion Sanhuang Diyu powder has inhibitory effect aganist the growth of muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa in rats,which maby related to its ability of regulating IL-1β and TNF-α.

Sanhuang Diyu powder;muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa;gentamicin;antimicrobial effect

R285.5；R378.99+1

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.003

2016-10-22

中西医结合基础湖南省“十二五”重点学科开放基金资助项目。

张 涛，男，本科在读，中西医临床医学专业。

*蔡 锐，女，硕士，副教授，E-mail:charry1203@sina.com。

本文引用：张 涛，伍君锋，肖新云，邓江艳，李帅东，刘俊青，蔡 锐.三黄地榆散对多重耐药铜绿假单胞菌的抑制作用研究[J].湖南中医药大学学报，2017，37（8）：823-826.