祁怡馨,谢立科,郝晓凤,张志芳,侯乐,肖文峥,孙会兰
逍生散颗粒对干眼杯状细胞影响的临床研究
祁怡馨,谢立科,郝晓凤,张志芳,侯乐,肖文峥,孙会兰
目的评价逍生散对杯状细胞的影响。方法符合纳入标准的30例(60只眼)干眼患者,随机分为对照组和中药组。对照组使用玻璃酸钠滴眼液,每次1滴,每日3次;中药组使用逍生散颗粒剂:柴胡、白芍、当归、党参、五味子、麦冬等。每日2次,每次1袋,温水冲服。观察并记录患者治疗前及治疗4周后的自觉症状、泪液分泌、泪膜破裂时间、荧光素钠染色、结膜印迹细胞学检查。结果中药组患者在自觉症状、泪膜破裂时间、泪液分泌及角膜荧光染色、杯状细胞数量及等级方面具有较为明显的改善,与治疗前相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。对照组在自觉症状、角膜荧光染色、杯状细胞数量方面有改善作用,与治疗前相比,差异具有统计学意义(P<0.05),而在泪液分泌、泪膜破裂时间、杯状细胞等级方面虽有所改善,但差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后将中药组与对照组在自觉症状、泪膜破裂时间、泪液分泌、角膜荧光染色、杯状细胞数量及等级方面进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论逍生散颗粒剂可明显改善患者的自觉症状,增加泪液分泌量,延长泪膜破裂时间,提高泪膜稳定性,减少杯状细胞凋亡,减轻眼表损伤等作用。
干眼;逍生散;杯状细胞;免疫相关性炎症
干眼是由泪液量、质或流体动力学异常引起泪膜的不稳定,可伴有眼表的损害,从而出现眼部的不适,以及视功能障碍之疾病。2007年国际干眼研讨小组总结报告目前世界范围干眼发病率约在5.5%-33.7%,美国流行病学调查得出48岁以上人群之中14.4%的人群有干眼,日本地区发病率约为17.0%,而澳大利亚地区发病率约为10.3%。目前我国尚未见干眼流行病学明确的调查研究,基于我国医疗卫生条件及环境状况,保守估计目前我国干眼患者大约在1亿以上。本病是眼科常见的眼表疾病,主要症状为眼干燥感、不适感、异物感,畏光流泪以及视物模糊等,重者可引起角膜炎,严重影响患者生活及生存质量。
逍生散为谢立科主任医师总结多年临床经验,遵循眼科古籍,针对当今发病之病因病机,以逍遥散、生脉饮作为基本用药形成的经验方。逍遥散是疏肝健脾要方,生脉饮是养阴生津良剂,二方合用可润目生津,疏肝养阴,使肝气条达,阴津充盛,睛珠滑顺,目窍得养。
1.1 研究对象
本观察病例来自于中国中医科学院眼科医院2015年6月至2016年2月的门诊患者,完成该试验干眼患者共计30例(60只眼),其中女18例(36只眼),男12例(24只眼);患者年龄在22-56岁;病程2个月到6年。对照组女8例,男7例,试验组女10例,男5例,两组患者在性别、年龄及病程等方面差异均无统计学意义(P>0.05),组间具有可比性。
1.2 诊断、纳入及排除标准
诊断标准:参考干眼临床诊疗专家共识(2013):(1)眼部有干燥感、异物感等自觉症状;(2)BUT<5秒;(3)SIT<5mm/5分钟;(4)荧光素钠染色,角膜上皮见散在点状着色。证型标准:患者具有肝郁阴虚表现,即眼部干涩、不适、异物、烧灼、疲劳感,偶眼红刺痒、畏光流泪、视物模糊等症状;同时伴有情绪烦躁或低落、胸闷胁胀、咽干口苦,五心烦热等,舌干红少苔,脉弦细等。
纳入标准:(1)符合干眼诊断标准;(2)辨证为肝郁阴虚证者;(3)无严重心脑血管及全身疾病;(4)治疗期内未进行其他治疗;(5)所有纳入者均需签署知情同意书,且通过伦理委员会审核。
排除标准:(1)患有严重全身疾病患者、孕妇;(2)血、尿常规及肝肾功能严重异常者;(3)眼部先天性疾病、活动性眼病(如急慢性眼表炎症、急慢性泪囊炎等)、眼外伤等、眼部手术史。
1.3 分组及治疗方法
将符合纳入标准的30例(60眼)患者通过随机数字表分为对照组和试验组,每组15例。对照组予0.1%玻璃酸钠滴眼液点眼(日本参天株式会社生产),每日早中晚各1次,每次0.3ml,共用4周;中药组予逍生散颗粒剂(北京康仁堂药业配制),温水冲服至200ml,早晚两次空腹温服,共服药4周。
1.4 观察指标
症状评分:(1)主要症状:眼部干涩。无:0分,偶尔:2分,经常:4分,难忍:6分,总分为0~6分。(2)次要症状:包括异物感、疼痛感、畏光流泪、视物疲劳、眼红、眼痒及分泌物7项。每个症状为0~3分,共0~ 21分(表1)。将患者首次及末次就诊的症状问卷评分进行统计分析。
表1 干眼次要症状计分标准
泪膜稳定性:为避免其他检查对本检查造成干扰,当首行BUT。将患者下穹窿部滴入1%荧光素钠,于钴蓝光滤光镜下进行观察,采用秒表计时。裂隙灯下见泪膜首个黑斑出现就标志泪膜破裂,连续检查3次,取其平均值并记录。
泪液分泌:检查当在暗室内进行,分表面麻醉前、麻醉后两步来检查,具体方法为:5mm×35mm泪液检测滤纸,将一端折出5mm,放置于下穹隆部中外1/3交界结膜囊内,嘱患者双眼睑自然闭合,5分钟后观察滤纸湿润长度。之后于结膜囊内滴入1-2滴盐酸奥布卡因滴眼液,进行表面麻醉,5分钟后进行检测,方法同上。分别观察表面麻醉前后试纸浸湿长度,并进行记录及存档。
角膜荧光素染色:采用荧光素钠眼科检测试纸,将浸润荧光素钠部分蘸湿,将蘸湿部分轻轻接触受试者角膜或结膜,于钻蓝滤光片下进行观察。评分采用16分法。将角膜分成4个象限,每个象限单独计分,无染色为0分,1-30个点状着色为1分,>30个点状着色,但染色未融合为2分,弥散点状着色为3分,角膜点状着色出现融合、见丝状物或溃疡等为4分。将四个象限分数相加,共计得分为0~16分。
结膜印迹细胞学检查:(1)滤纸准备:孔径0.22μm的醋酸纤维素滤纸,将其剪为4mm×5mm梯形小纸片,蒸馏水浸洗4 h,消除滤纸表面活性。室温晾干后高压灭菌干燥待用。(2)取材方法:患者坐位或平卧位,盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉3-5min,采用消毒无齿镊轻夹醋酸纤维素滤膜一角,将粗糙面置于鼻侧球结膜,稍加压5-10 S后取下,放置于95%乙醇中最少固定1小时后行PAS染色。
杯状细胞数量:目前采取公认的Nelson’s分级方法,其鳞状上皮细胞之化生分为四个等级;0级(正常):上皮细胞小而圆,易分辨,核浆比例为1∶1~ 1∶2,杯状细胞数>500个/mm2。I级(轻度):上皮细胞多形,较大,较易分辨,其细胞间距较0级大,核浆比例为1∶3,杯状细胞数为350-500个/mm2。II级(中度):上皮细胞较大,多形,其分辨较差,细胞间距较大,核浆比例为1∶4~1∶5,杯状细胞为100-350/mm2。Ⅲ级(重度):上皮细胞大,多形,多见孤立,核浆比例>1:6,杯状细胞的数量严重下降甚至消失。于高倍镜下任意选择5个观察视野,0级为0分,I级为1分,II级为2分,Ⅲ级为3分,计算杯状细胞数目,取其平均数。
1.5 疗效指数及分级标准
参考《中医病证诊断疗效标准》,疗效分为显效、有效、无效三级。显效:SchirmerⅡ测试3次平均值>5mm/5分钟,且疗效指数>70%。有效:泪液分泌较前增加但<5mm,且疗效指数为30%-69%。无效:泪液分泌未见明显增加,且疗效指数<30%。
1.6 统计分析
使用spss20.0软件进行统计分析。计量资料描述均采用x±s表示。组间比较采取配对资料t检验。计数资料组间的比较采取单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。
2.1 症状评分
治疗后对照组及中药组的自觉症状均有所改善,其中对照组由治疗前的(14.03±4.01)分降为(10.36±3.94)分(P=0.001),中药组由治疗前(16.06± 3.50)分降为(8.43±2.66)分(P<0.001),差异均具有统计学意义。中药组治疗后的自觉症状积分较对照组低,P=0.03,差异具有统计学意义。
2.2 泪液分泌、泪膜破裂时间、角膜荧光染色(表2)
治疗后对照组及中药组麻醉后的泪液分泌量均有所增加。对照组泪液分泌较前有所增加,但经配对t检验,差异无统计学意义(P=0.161>0.05);中药组泪液分泌较治疗前增加明显,差异有统计学意义(P<0.001)。治疗后两组泪液分泌比较,中药组泪液分泌较对照组有所增加,差异具有统计学意义(P<0.001)。两组治疗前后泪膜破裂时间均有所延长,差异均具有统计学意义(P<0.001)。治疗后两组泪膜破裂时间比较,中药组泪膜破裂时间较对照组时间有所延长,差异具有统计学意义(P=0.002)。治疗后两组角膜荧光染色情况较治疗前均有明显好转,差异有统计学意义(P<0.001)。治疗后两组角膜荧光染色比较,中药组角膜荧光染色分数较对照组稍低,但差异不具有统计学意义(P=0.128>0.05)。
表2 两组干眼患者治疗前后泪液分泌、泪膜破裂时间、角膜荧光染色的比较(±s)
表2 两组干眼患者治疗前后泪液分泌、泪膜破裂时间、角膜荧光染色的比较(±s)
注:组内比较采用配对t检验,组间比较采用独立样本t检验。
泪液分泌(mm)泪膜破裂时间(S)角膜荧光染色(分)组别眼数(只)治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后对照组30 3.01±1.20 3.47±1.34 3.53±1.18 3.81±1.32 3.13±1.16 1.23±0.85中药组30 2.83±0.92 4.76±1.11 2.95±1.05 4.85±1.20 3.03±1.18 1.80±0.61 t值1.237-4.033 2.169-3.173 1.072-2.254 P值0.765 0.000 0.826 0.002 0.579 0.286
2.3 结膜印迹细胞学
结膜印迹细胞学检查可见杯状细胞深红色着染,分为分泌端及基底部,其中分泌端为较模糊端(图1)。治疗后对照组及中药组杯状细胞数量较治疗前均有所增加,对照组数量由(103.10±8.20)个增加为(159.83±9.54)个,中药组数量由(104.16±6.92)个增加为(191.33±8.10)个,采用配对t检验,差异均具有统计学意义(P<0.001),治疗后中药组杯状细胞数量较对照组有所增加,差异具有统计学意义(P<0.001)。在杯状细胞分级方面,对照组分级由(1.96± 0.80)级降低为(1.56±0.81)级,差异均具有统计学意义(P=0.062),中药组由(2.03±0.99)级降低为(0.66± 0.60)级,差异均具有统计学意义(P<0.001),治疗后中药组杯状细胞等级较对照组有所降低(图2),差异具有统计学意义(P<0.001)。
2.4 疗效评价
根据自觉症状积分和各项检查结果,得出对照组和中药组治疗后疗效指数分别为(29.97±12.98)%及(41.93±14.11)%,中药组疗效指数高于对照组,经独立样本t检验,P<0.001,差异有统计学意义。对照组显效3.33%,有效75.0%,无效21.66%,中药组显效6.66%,有效83.33%,无效10.00%。
图1 光镜下杯状细胞形态,可见细胞深红色着染,箭头所指为分泌端。图2光镜下结膜印迹学细胞检查,杯状细胞分级(0-3级)a:正常组,杯状细胞结构完整,数量正常;b:轻度干眼,杯状细胞结构不规整,数量稍减少;c:中度干眼杯状细胞结构破坏,数量减少;d:重度干眼,杯状细胞结构破坏明显,数量明显减少(× 400)
3.1 杯状细胞在干眼发病中的作用及机理
杯状细胞改变:本试验中的30例患者,根据Nelson’s分级方法,多为2级-3级之间,其数量为100个/mm2左右,且均存在杯状细胞损害。治疗后对照组Nelson's级别下降,多为1级-2级之间,杯状细胞数量增多,为159个/mm2左右,仍存在杯状细胞损害。治疗后中药组Nelson’s级别明显下降,多在0级-1级之间,杯状细胞数量明显增多,为191个/mm2左右,与对照组相比,差异均具有统计学意义。
杯状细胞损害与干眼相关性:基于免疫的炎症反应、细胞凋亡、眼表改变、性激素降低,均为干眼发生及发展的主要因素[1]。黏蛋白为富含糖链的高分子糖蛋白,是泪膜主体,其被泪液中水分所水化,而水化粘液胶含有小分子的有机物、电解质、多种蛋白,脂质层覆盖于外层[2]。目前共有17种上皮黏蛋白之基因序列可被测定。有研究表明,正常泪液分泌主要受到结膜杯状细胞的影响,若结膜杯状细胞功能正常而泪腺功能障碍,则泪液分泌一般不受影响,倘若结膜杯状细胞功能出现异常,即使泪腺功能正常,泪液分泌也会受到明显影响,眼部则将出现干燥症状[3-4]。Plugfelder等[5]发现水液缺乏型干眼患者杯状细胞数量及黏蛋白表达出现明显下降。有研究者应用高度敏感ELISA以及特异性的抗体,发现Sjögren综合征结膜上皮MUC5ACmRNA表达明显低于常人,泪液中MUC5AC的蛋白量也较常人偏低[6]。多项研究均表明干眼患者泪膜完整性遭到破坏,黏蛋白分泌量下降[7-9]。因此对结膜杯状细胞及调节因素的研究在干眼治疗中成为重要内容。
杯状细胞与干眼治疗:当结膜上皮细胞发生炎症反应,淋巴细胞所产生的炎症因子刺激一个或多个信号传导途径,激活蛋白激酶C(PKC)致IκB出现磷酸化,并与NFκBp65解离后,p50亚基核定位信号暴露,NF-κB激活并进入细胞核,进而诱导产生基因产物,其协同作用可抑制TNF-α诱发caspase-8激活,从而可抑制淋巴细胞凋亡,保持淋巴细胞持续活化[10]。NF-κB活化可以促进炎性因子表达,然而炎性因子表达增强则反过来又可进一步增强NF-κB活性,从而导致炎症进一步加重。有研究发现MAPK信号通路可通过激活各靶细胞NF-κB等转录因子,从而调控相应基因发生转录激活及产物表达[11]。因此,通过抑制结膜上皮细胞NF-κB活性,从而调控相关基因表达,减轻结膜上皮细胞炎症反应,促进淋巴细胞凋亡,阻止杯状细胞凋亡为干眼治疗新的靶点之一。
3.2 逍生散释义及可能作用机理
干眼属于中医学的“白涩症”“神水将枯”范畴。其病因病机多为脾肺两经郁热内伏,津液敷布障碍,或外邪侵袭,致使肺卫气郁不舒,生燥伤津,肺阴不足,不可上荣于目,或因年老体虚,肝肾亏耗,目失濡养。干眼与神水关系密切,发病与肝郁及阴虚相关。《黄帝内经》曰“肝开窍于目”“目为肝之候”“肝在液为泪”。泪液的生成与肝之疏泄有密切的关系。肝所受藏之精血上输于目,目受滋养,以维持泪膜正常的功能;反之肝郁不达,阴精化生不足,泪液匮乏,目失濡润,则神水将枯。逍生散为逍遥散及生脉饮之合方加减,药物有柴胡、当归、白芍、五味子、党参、麦冬等,方中逍遥散为疏肝健脾之首方,生脉饮为养阴生津之良剂,方中柴胡疏肝解郁为君;当归养血和血,白芍养血敛阴,党参益肺生津,五味子、生地、麦冬养阴生津共为臣;薄荷一则疏散肝经郁遏之气,二以透达肝经郁热,三以引诸药入肝经,协同甘草调和诸药以为佐使。全方疏肝养阴、润目生津;阴津充盛,肝气条达,则睛珠顺滑,目窍得养。
现代药理学研究显示,柴胡有显著抗炎作用,其所含之柴胡皂苷(SS)为抗炎有效成分。柴胡皂苷对渗出、炎症介质释放等许多炎症过程等都具有明显影响,对机体特异性及非特异性免疫功能均具有调节作用[12]。白芍有效成分为白芍总苷,可调节T、B淋巴细胞。近年来国内外多位学者研究发现白芍总苷可显著降低大鼠脾淋巴细胞、滑膜细胞、腹腔巨噬细胞之TNF-α、IL-1、IL-2、NO、PGE2分泌。白芍总苷能显著抑制前列腺素E(PGE)、IL-1、TNF-α、白三烯(LT)等与疼痛感觉相关细胞因子的表达,以达到抗炎效果[13]。生地减低毛细血管通透性,参与血管扩张,抑制血管内皮炎症,促进淋巴细胞IL-2的产生,增强细胞免疫功能[14]。当归可以促进TNF-γ、IL-2等细胞因子的表达,可达到抗炎、保肝利胆、保护肾脏、增强免疫功能、清除氧自由基等作用[15]。麦冬主要成分为麦冬皂苷以及麦冬多糖等,其中麦冬多糖有较高的免疫活性,可促进细胞、体液的免疫功能,从而提高血清溶血素抗体水平[16]。党参中党参多糖为其主要成分,可增强小鼠巨噬细胞吞噬活性,增强机体整体免疫反应[17]。五味子主要有效成分为五味子多糖,具有较好的免疫兴奋作用,可增加免疫抑制小鼠胸腺及脾脏重量,并可明显对抗环磷酰胺所导致小鼠白细胞减少,可促进淋巴细胞转化[18]。薄荷主要有效成分有薄荷醇、薄荷酮及儿茶萘酚酸,均为有效抗炎成分,能抑制3α-羟类固醇脱氢酶表达,具有明显抗炎作用[19]。
综上所述,本研究中中药组患者自觉症状有明显改善,在泪液分泌、角膜染色、泪膜破裂时间及杯状细胞数量等方面均好转,且差异均具有统计学意义(P<0.05);而对照组在改善症状、角膜荧光素钠染色、泪膜破裂时间、杯状细胞数目改善方面有较好效果,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明逍生散在改善干眼患者的自觉症状、增加泪液分泌、杯状细胞数量等方面优于玻璃酸钠滴眼液。可能与逍生散颗粒剂具有抗炎作用,在泪膜稳定性下降的早期,通过免疫调节作用[20],降低或抑制炎性反应强度,减少促炎细胞因子释放[21],以影响眼表上皮细胞、淋巴细胞及泪腺之凋亡,并防止杯状细胞之凋亡以发挥其药理作用,从而达到抑制或延缓干眼形成[22-22],但其具体作用机制尚需进一步研究证实。
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Effectof Xiaosheng Powder on goblet cells in dry eye patient
QIYixin,XIE Like,HAO Xiaofeng,etal.
Eye Hospital,China Academy ofChineseMedical Sciences,Beijing100040,China
OBJECTIVE To observe the efficacy of Xiaosheng Powder on goblet cells.METHODS A totalof 30 dry eye cases(60 eyes)were included and randomly divided into controlgroup and powder group.Patients in formergroup were treated by sodium hyaluronate eye drops,one drop each time,four timesa day.While participants in latter group were administrated with Xiaosheng Powder a bag each time,twice a day.This formulawasmainly consisted of Baishao,Chaihu,Dangshen,Danggui,Wuweizi,Maidong,etc.Symptoms,break up time(BUT),Schirmer’s test(SIT),fluorescein staining(FL),impression cytology(IC)ofpatientswere observed and documented before and 4 weeksafter treatment.RESULTS After the treatment,symptoms,and BUT,SIT,the number and grade ofgobletcell and FL of granule group improved significantly(P<0.05).For control group,improvementof symptoms,FL and the grade ofgoblet cellwere of statistical difference(P<0.05),while SIT,BUT and the number ofgoblet cell showed no significant variation(P<0.05).Comparisons of these parameters listed above between two groups after treatmentall demonstrated statisticaldifference(P<0.05).CONCLUSIONS The Xiaosheng Powder relieved symptomsofdry eye, increased the tear secretion,prolonged BUT,elevated tear film stability,reduced apoptosis of goblet cell and alleviated ocularsurface damage.
dry eye;Xiaosheng Powder;gobletcells;immune-related inflammation
R777.34
A
1002-4379(2017)03-0163-06
10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.03.006
国家自然科学基金(81273805)
中国中医科学院眼科医院,北京100040
谢立科,bjxielike@sina.com