固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水中13种抗生素的含量

陈小平，邓小娟*，李文斌，顾春燕，晋立川

(1.天津大学分析中心，天津300072;2.迪马科技有限公司，天津300402)

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水中13种抗生素的含量

陈小平1，邓小娟1*，李文斌2，顾春燕2，晋立川2

(1.天津大学分析中心，天津300072;2.迪马科技有限公司，天津300402)

采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水中13种抗生素的含量。水样中的抗生素富集于PLS固相萃取柱上，用甲醇洗脱，洗脱液进行LC分离，以Endeavorsil C18色谱柱为分离柱，以不同体积比的0.4%(体积分数)甲酸-水溶液和甲醇-乙腈(40+60)溶液的混合液为流动相进行梯度洗脱。质谱分析中，采用电喷雾正离子源多反应监测模式检测。13种抗生素均在一定的质量浓度范围内与其对应的峰面积呈线性关系，方法的检出限(3S/N)在0.4～1.5 ng·L－1之间。以空白样品为基体进行加标回收试验，所得回收率在70.4%～101%之间，测定值的相对标准偏差(n=5)在1.1%～4.8%之间。

超高效液相色谱-串联质谱法;固相萃取;抗生素;水

抗生素广泛用于畜禽养殖行业，但大多不被畜禽充分吸收，而随排泄物进入环境，对地表水和地下水造成潜在威胁，进而影响人类饮用水的水质［1-5］。抗生素对人体的危害表现在毒性损伤、变态反应和过敏反应等。近年来，在环境中检出抗生素的事件时有发生，据报道，全国主要河流部分位点中检出了脱水红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶等抗生素，部分居民自来水中也被检出了四环素、土霉素和金霉素等抗生素。因此，建立快速、准确的水中抗生素的分析方法尤为迫切和必要。目前测定抗生素常用的方法主要有液相色谱法［6-10］和液相色谱-串联质谱法［11-16］。液相色谱法测定易受杂质干扰，灵敏度低;而液相色谱-串联质谱法具有高效分离、灵敏度高、检测快速、定性与定量检测于一体等优点，已成为近年来痕量残留检测技术的主流方向。目前我国还没有建立全面的水中抗生素检测标准，而饮用水中抗生素含量较低(痕量级)且存在一定的基质干扰，因此许多文献报道的分析方法都呈现涉及抗生素类别少(不大于3类)、灵敏度有限、回收率结果参差不齐，不能实现水体中多类抗生素的同时快速检测等现象。与普通高效液相色谱法(HPLC)相比，基于1.8μm填料的超高效液相色谱法(UHPLC)具有更高的灵敏度、更快的分析速率和更强的分辨率。固相萃取(SPE)技术是一种常用的样品前处理方法，主要用于样品的分离、净化和浓缩，可以降低样品基质干扰，提高检测的灵敏度。本工作采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法(SPEUHPLC-MS/MS)测定水中4类13种抗生素的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Ekspert ultraLC 100型超高效液相色谱仪;API 4000+型串联质谱仪，配加热电喷雾离子源(H-ESI源);Milli-Q型超纯水仪;OHAUS CP114型分析天平;XH-C型涡旋混合器;HSC-24B型氮吹仪。

13种抗生素标准储备溶液:100 mg·L－1，分别称取马波沙星(MFX)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺吡啶(SPD)、土霉素(OTC)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、四环素(TC)、恩诺沙星(ENR)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、双氟沙星(DIF)、沙拉沙星(SAR)、金霉素(CTC)、脱水红霉素(ERY-H2O)等13种抗生素标准品各5.0 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀。于－20℃避光保存。

13种抗生素标准溶液:用甲醇稀释100 mg· L－1的13种抗生素标准储备溶液，配成1 mg·L－1。于4℃密封保存，现配现用。

乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件Endeavorsil C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm)，柱温为35℃;进样量为5μL;流量为0.2 mL·min－1;分析时间为15 min。流动相:A为0.4%(体积分数，下同)甲酸溶液，B为甲醇-乙腈(40+60)溶液。梯度洗脱程序:0～4.5 min时，B为20%;4.5～5.5 min时，B由20%升至100%，保持2 min;7.5～8.0 min时，B由100%降至20%，保持7 min。

2)质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式;多反应监测模式(MRM);离子源温度500℃;电喷雾电压4 500 V;雾化器压力345 kPa，辅助气压力345 kPa，气帘气压力138 kPa。其他质谱参数见表1，其中“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

室温下将水样经0.45μm滤膜过滤，量取水样200 mL和pH 4.0的Mcllvaine缓冲溶液100 mL，置于500 mL玻璃烧杯中，混匀，待上柱净化。依次用甲醇5 mL、水5 mL活化PLS固相萃取柱，然后将待净化样品液转移至固相萃取柱中，弃去流出液;加入水10 mL淋洗，弃去淋洗液，负压抽干固相萃取柱;最后加入甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液。取洗脱液在35℃水浴条件下，用氮气吹干，用0.4%甲酸-甲醇定容至1 mL，并过0.22μm微孔滤膜，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按仪器工作条件对13种抗生素标准溶液进行测定，色谱图见图1。

2.2 色谱和质谱条件的选择

2.2.1 色谱条件

图1 13种抗生素标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of13 antibiotics standard solution

试验考察了反相色谱常用的几种流动相对13种抗生素色谱分离的影响。结果表明:以甲醇-水或乙腈-水为流动相时，多数抗生素峰宽且均有拖尾现象。在流动相中加入甲酸后，有助于消除填料与分析物之间的相互作用，减少拖尾，改善峰形。与甲醇相比，乙腈作为流动相时洗脱能力较强，且甲醇-乙腈(40+60)溶液作为流动相时响应值较高，进而可缩短分析时间和提高灵敏度。试验选择0.4%甲酸溶液和甲醇-乙腈(40+60)溶液作为流动相。

2.2.2 质谱条件

在流动注射状态下，分别将200μg·L－1抗生素标准溶液在正离子和负离子模式下进行全扫描，以选择合适的分子离子峰和电离方式。结果表明:正离子模式下的离子响应明显高于负离子模式下;在正离子模式下，［M+H］+为最强峰，选择其作为母离子进行下一步的碰撞诱导解离。在电喷雾正离子模式下，对母离子施加一定的碰撞能量，使其产生特定的子离子，然后优化各化合物的二级质谱的电离电压、碰撞能量等参数，选择丰度强且干扰较小的两对子离子为定性离子，丰度最高的作为定量离子。试验选择的质谱参数见1.2节。

2.3 样品前处理条件的选择

2.3.1 固相萃取柱

试验考察了C18和PLS两种固相萃取柱对测定的影响，在空白水样品中添加50 ng·L－1的抗生素标准溶液进行回收试验。结果表明:经C18固相萃取柱净化，大部分待测物的回收率明显较低;经过对比发现，在目标化合物出峰时间段，采用PLS固相萃取柱的背景干扰最小，有利于保护仪器。C18固相萃取柱的填充材料具有疏水特性，适用于萃取、净化或富集非极性到中等极性化合物;PLS固相萃取柱的填充材料具有亲水亲油平衡的特性，对不同极性、不同酸碱性及中性化合物均有较好的吸附效果，通用性强。试验涉及4类抗生素，性质相差较大，需使用综合性固相萃取柱方可有效净化、浓缩全部抗生素。试验选用PLS固相萃取柱进行样品净化处理。

2.3.2 洗脱剂和洗脱剂体积

以PLS固相萃取柱净化，以添加50 ng·L－1抗生素标准溶液的空白水样为样品，比较了氨水-甲醇(5+95)混合液和甲醇为洗脱剂时抗生素的回收率。结果表明:氨水-甲醇(5+95)作为洗脱剂时，抗生素回收率不稳定，尤其是四环素和喹诺酮类抗生素的回收率明显下降;以甲醇作为洗脱剂时，可以得到满意且稳定的回收率。试验选用甲醇为洗脱剂。

为了节省溶剂，并避免洗脱剂过多导致洗脱的杂质量增多的现象发生，试验对洗脱剂体积进行了考察。分段收集流出液，每1 mL收集一次，收集至10 mL为止，将洗脱液浓缩、定容后按仪器工作条件进行测定，计算累计回收率。结果表明:洗脱剂体积为5 mL时，累计回收率达到最高;洗脱剂大于5 mL后，收集的洗脱剂累计回收率几乎不变。试验选用洗脱剂体积为5 mL。

2.3.3 缓冲溶液

试验比较了水样直接过柱和加入pH 4.0的Mcllvaine缓冲溶液后过柱对抗生素回收率的影响。结果表明:加入pH 4.0的Mcllvaine缓冲溶液后，磺胺类抗生素和四环素类抗生素的回收率明显提高，喹诺酮类抗生素的回收率稍有下降，大环内酯类抗生素回收率影响不大。这是因为磺胺类抗生素的解离受酸度影响较大，酸性条件下可促进磺胺类抗生素的电离;抗生素特别是四环素类抗生素容易与重金属元素发生配合或螯合作用，形成稳定的配合物或螯合物，从而影响相关待测物的检测;Mcllvaine缓冲溶液中的乙二胺四乙酸二钠盐是一种良好的螯合剂，容易与多种金属形成螯合物，能减少重金属元素对检测的干扰。综合考虑，200 mL水样中加入Mcllvaine缓冲溶液100 mL来调节样品酸度，并能消除重金属元素的影响。

2.3.4 过柱体积

在测定水中微量抗生素兽药残留时，在降低基质干扰的前提下应尽量提高样品的浓缩体积，以提高待测物的检出限，保证检出更多的待测物。但是固相萃取柱的容量有限，一般用穿透体积来评价。试验分别用200，400，600 mL样品过柱，考察过柱体积对回收率的影响。结果表明:当过柱体积为200mL时，所有抗生素的回收率均较好;当过柱体积为400 mL时，部分抗生素的回收率有所下降，其中马波沙星的回收率下降最多;当过柱体积为600 mL时，所有抗生素的回收率均有所下降，说明样品抗生素已经达到穿透体积。试验选择过柱体积为200 mL。

2.4 基质效应的影响

基质是样品中分析物以外的组分，与分析物共洗脱出来的样品基质会干扰分析物的离子化过程，造成离子化抑制或增强，产生基质效应(ME)。基质效应会影响方法的检出限、测定下限、准确度和精密度等。13种抗生素在水中的基质效应通过基质匹配标准溶液和溶剂标准溶液在线性范围内的斜率比进行评价。基质效应大于1时，表明存在离子化增强效应;基质效应小于1时，表明存在离子化抑制效应。13种抗生素(按表2的顺序)在水中的基质效应依次为0.99，0.97，1.39，1.44，1.09，1.32，0.9，1.15，1.56，1.01，0.82，1.32，1.2，马波沙星、沙拉沙星、恩诺沙星和磺胺嘧啶为离子化抑制效应，其他均为离子化增强效应。由于基质效应的存在，试验采用基质匹配标准溶液进行定量分析，以减小基质效应的干扰。

2.5 标准曲线和检出限

按仪器工作条件对一定质量浓度范围内的5个基质匹配标准溶液进行测定，以抗生素的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:13种抗生素均在一定的质量浓度范围内与其峰面积呈线性关系，其线性范围、线性回归方程、相关系数见表2。

以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，其结果见表2。

表2 线性范围、线性回归方程、相关系数及检出限Tab.2 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.6 方法的准确度和精密度

移取适量的13种抗生素混合标准溶液于空白自来水样品和空白河水样品中，配成添加水平分别为50，100，200 ng·L－1的13种抗生素待测样品溶液，每个添加水平样品制作5份。按照试验方法处理样品，并进行测定，其结果见表3。

由表3可知:13种抗生素的加标回收率在70.4%～101%之间，测定值的相对标准偏差在1.1%～4.8%之间。

2.7 样品分析

按试验方法分别采集当地饮用水样3份、河水样品3份，测定其中抗生素的残留量。结果表明:饮用水中均未检出抗生素;其中一份河水样品中检出脱水红霉素和磺胺甲基嘧啶，测定值分别为13.7，8.9 ng·L－1，其余两份河水样品均未检出抗生素。

固相萃取可有效富集、净化样品，超高效液相色谱-串联质谱法可高效、灵敏检测目标化合物，基于此本方法建立了的水中4类13种抗生素的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱检测法。方法具有简单、快速、灵敏度高、重现性好等优点，适用于水中多种抗生素的同时快速检测，可为水中相关抗生素兽药残留分析和环境风险评价提供科学试验依据。

表3 准确度和精密度试验结果(n=5)Tab.3 Results of tests for accuracy and precision(n=5)

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UHPLC-MS/MS Determination of 13 Antibiotics in Water with Separation by Solid Phase Extraction

CHEN Xiaoping1，DENG Xiaojuan1*，LI Wenbin2，GU Chunyan2，JIN Lichuan2
(1.Analytical Center，Tianjin University，Tianjin 300072，China; 2.Dikma Technology Co.，Ltd.，Tianjin 300402，China)

UHPLC-MS/MS was applied to the determination of13 antibiotics in water with solid phase extraction.The antibiotics in water sample were enriched on PLS solid phase extraction column，and then eluted with 5 mL of methanol.LC separation was performed by using Endeavorsil C18chromatographic column as stationary phase，and the mixture of0.4%(φ)formic acid solution and methanol-acetonitrile(40+60)solution with various ratios as mobile phase in gradient elution.ESI+and multi-reaction monitoring were adopted in MS/MS.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of the 13 antibiotics were kept in definite ranges，with detection limits(3S/N)in the range of0.4－1.5 ng·L－1.On the base of blank sample，test for recovery was made by standard addition method;values of recovery found were in the range of70.4%－101%，with RSD's(n=5)in the range of1.1%－4.8%.

UHPLC-MS/MS;solid phase extraction;antibiotics;water

O657.63

A

1001-4020(2017)05-0542-06

10.11973/lhjy-hx201705010

2016-05-11

国家自然科学基金青年科学基金(201506147)

陈小平(1960－)，男，湖北武汉人，工程师，主要研究方向为仪器分析化学

*通信联系人。fxzx_tju@163.com