母猪流行性腹泻返饲后免疫应答评估

简义虎，李润成，胡仕凤，葛 猛，余兴龙

（湖南农业大学动物医学院, 湖南 长沙 410128）

母猪流行性腹泻返饲后免疫应答评估

简义虎，李润成，胡仕凤，葛 猛，余兴龙*

（湖南农业大学动物医学院, 湖南 长沙 410128）

当前，猪流行性腹泻病毒（PEDV）流行广、危害严重。除进行疫苗免疫工作外，返饲常常做为猪场控制猪流行性腹泻的重要手段。笔者用6头育肥后期猪模拟母猪返饲（攻毒）实验，研究母猪返饲后排毒情况与血清抗体消长变化，来探究母猪返饲最佳时机以及如何避免返饲带来的风险。结果表明，试验猪在返饲后第2、3天相继发生腹泻并检测到PEDV，在返饲后11 d猪血清中IgG抗体明显上升,并在攻毒后第20天IgA与IgG检测值均达到峰值,在攻毒后第15天唾液与粪便均检测不到病毒。说明，生产上在产前15 d到30 d之间返饲效果较好，病毒感染仔猪的风险最低。为临床防控该病提供理论依据。

母猪；流行性腹泻；返饲

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种严重的病毒性传染病。该病具有极高的感染性，可引起猪群发生严重的腹泻，特别是7日龄以内哺乳仔猪，致死率极高[1]。本病虽多发生于寒冷季节，但在夏季也存在感染发病的情况[2]。该病已经被加拿大、亚洲、及其他欧洲国家报道,2013在美国也报道过该疾病，并在一年的时间里对美国的养猪业造成高达9亿～18亿美元的经济损失[3]。对于PED防治问题，仍然困扰着国内大多数猪场,现市场上对于防治PED的疫苗虽有很多,但是PEDV还是出现于免疫猪群中,说明疫苗免疫保护效果不佳。特别在2010年以后我国PED的发病趋势更加严重,不同阶段的猪群均出现严重的腹泻、呕吐与脱水,部分猪场初生仔猪的死亡率高达100%,对我国养猪业造成了巨大经济损失[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要诊断试剂

PEDV检测胶体金购自Bionovet公司；RNA提取试纸盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；RNA反转录试纸盒购自美国Thermo Scientfic；PCR MIX购自北京擎科新业生物技术有限公司。检测引物见参考文献[2]，引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。

1.1.2 样品

收集攻毒后实验猪的腹泻粪便与唾液，以及攻毒前后攻毒猪血清。

1.2 方法

1.2.1 返饲及采样方案

1）返饲前病料处理：取PEDV阳性初生仔猪肠道以及内容物300 g，经病原检测无猪瘟、猪伪狂犬和蓝耳病病原后，加入300 mL含青链霉素各60万单位的生理盐水，用组织捣碎机匀浆，取1 mL匀浆后的病料于-80 ℃保存，配合荧光定量PCR[5]测定返饲病料中病毒的拷贝数，返饲病料及时保存于4 ℃，并在1 h内进行返饲。

2）返饲：猪舍提前3 d彻底消毒，并用大量清水将猪舍冲洗干净，为了促进猪发生腹泻，在生猪运输前不控料、运输到实验室后马上进行返饲，并且不进行控料和胃肠功能调理工作。用保定绳对猪上颚进行保定，并抬高猪的头部，每头猪缓慢灌服100 mL返饲病料，灌服时不断轻轻揉捏猪喉头，加快猪的吞咽动作避免浪费。

3）返饲后饲养管理：6头猪分为3栏饲喂（栏舍宽2 m，长2.5 m），攻毒期间打开猪舍内两个吊扇（美的牌屋顶式吊扇调至最高档），返饲期间气温为19～25 ℃，返饲后每天早上8点到夜晚10点，每隔3 h用冷水冲洗猪舍与猪臀部，返饲后第4天停止对猪与猪舍凉水冲洗，并关闭猪舍内的吊扇。腹泻期间让猪只自由采食，腹泻第2天在饲料中添加适量的红糖与食用盐，腹泻好转后每天分2次饲喂，并停止使用红糖与食用盐，攻毒后第6天给生猪饲喂含益生菌的饲料添加剂，调节胃肠道功能。

4）样本采集：腹泻期间每隔3 h收集一次腹泻粪便并做好标记，腹泻好转后每隔7 d收集一次粪便和肛门拭子，并用唾液收集条采集唾液，样本收集后全部保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 病原检测

1)将攻毒后生猪第一次腹泻的粪便进行收集，并用韩国金诺生产的胶体金PEDV检测试剂盒按说明书进行检测；

2)将攻毒后第3天与第6天6头猪腹泻粪便，以及攻毒后第15天6头猪的唾液与肛门拭子。分别按照RNA提取试剂盒与RNA反转录试剂盒说明书，采用RT-PCR方法检测PEDV，同时对攻毒后第3天的腹泻样品用荧光定量PCR测定病毒的CT值与拷贝数。

1.2.3 血清抗体检测

攻毒后每隔4～7 d对猪耳缘静脉采集一次血清，将采集的血清按本实验室建立的方法[6]，进行PEDV IgG、IgA抗体检测。

2 结果

2.1 攻毒后第一次腹泻粪便PEDV胶体金检测结果

在攻毒后第2天有5头猪发生腹泻，第3天6头猪全部发生腹泻，取攻毒后第一头腹泻猪的粪便进行PEDV检测，结果在胶体金的质控带与检测带都出现了阳性条带，说明攻毒后第1头腹泻猪的粪便为PED阳性，部分检测结果见图1。

2.2 攻毒后第3天腹泻粪便PEDV RT-PCR检测结果

分别采取6头猪攻毒后第3天的排泄物，经RT-PCR （30循环）检测，各个样品在477 bp处均有一条特异性条带，说明6份样本PEDV检测均为阳性（图2），攻毒后第6天的腹泻粪便检测带信号稍弱一些，攻毒后第15天收集的唾液与粪便棉签PEDV全阴性。

由图1的结果可知，在第1头腹泻猪的粪便中可检测到PEDV，故在图2中没有设置阳性对照样品，攻毒后第3天猪腹泻粪便经RT-PCR检测中条带很亮，可以说明6头猪已全部感染PEDV并出现排毒；而攻毒后第15天的唾液与粪便棉签检测全阴，说明6头猪体内已无PEDV。

2.3 返饲病料与部分腹泻样品荧光定量PCR检测结果

利用荧光定量PCR检测技术，分别对返饲病料与攻毒后第3天6头猪的腹泻粪便进行检测，其病毒检测的CT值与拷贝数如表1所示。

2.4 血清抗体IgA、IgG检测结果

将攻毒前后6头猪所采集血清分别进行PED抗体检测,并求出血清中IgA与IgG平均 OD值，结果见表2、图3。由表2和图3可见在攻毒后11 d猪血清中IgG抗体明显上升,并在攻毒后第20天IgA与IgG检测值均达到峰值。

3 分析与讨论

国外猪场在发生PED时，通常采用返饲技术控制了疫情，例如美国在2013年暴发PED，就是采取返饲措施及时控制了疾病[7]，而国内猪场很少有成功利用返饲的案例，可能主要有2个方面原因的影响，一方面说明部分猪场在返饲的技术上缺乏正确的指导方案；另一方面暗示着部分猪场担忧返饲的安全性。

目前国内虽有上市的PEDV弱毒疫苗，但是效果仍在观察中，并且不能口服免疫，在这种情况下，返饲可作为一种选择。国外也有学者研究PEDV的攻毒实验，例如：在De Arriba ML PEDV接种试验中，仔猪的腹泻持续时间平均时间为1.7 d，持续排毒时间平均为5.4 d[8]。由于本试验为了模拟寒冷的天气，对攻毒猪采取了冲凉水与风扇降温，从而使本试验猪腹泻时间比De Arriba M L接种PEDV的试验猪要长，根据各个猪场饲养管理的不同,腹泻持续时间不等,一般在腹泻一周以内逐渐好转[9]。临床上在促进猪群同期感染后，还需采取适当措施避免腹泻过度，例如对母猪返饲后，可通过加强隔离与消毒，改善环境温度与控制饲喂量，以及在饲料中添加一些微生态制剂，可以缩短母猪腹泻与排毒时间，并且同样能达到返饲效果。

图2 攻毒后6头猪第3天的排泄物RT-PCR检测结果

表1 检测返饲病料与攻毒后第3天腹泻粪便的病毒CT值与拷贝数

表2 攻毒前后血清抗体检测平均OD值

图3 表2中数据对应的矩形图

由于试验动物是育肥后期猪，每次冲水就有猪站立排粪，能清楚的记录腹泻时间与对应猪编号，使数据更加准确。虽然本试验不能确定母猪攻毒后第几天停止排毒，但是可以明确母猪在攻毒后临床表现腹泻症状时，就开始向外界排毒，并且在攻毒后15 d的唾液与粪便中无PEDV。然而临床上攻毒15 d后，对攻毒猪仍然不能掉以轻心，在4 ℃ pH=5～9的条件下，PEDV可在污染的泥土中至少存活28 d[10]，由表1可知，返饲后第3天腹泻粪便中病毒的拷贝数与返饲病料相当，说明猪舍环境中可能有大量病毒粒子的存在，为了防止PEDV在猪场的传播，母猪在攻毒后需对猪只体表与猪舍加强消毒，及时处理腹泻粪便，可以降低病毒感染其他猪群的风险。

由图3可知﹕母猪在攻毒后抗体在11～30 d，血清中IgA与IgG的抗体滴度维持在较高的水平，结合试验猪攻毒后第15天排泄物病原检测结果。对于母猪的返饲工作，可在其妊娠期的84到99 d之间进行返饲，尤其是对于一些正在发生PED的猪场，可对所有处于产前15 ～30 d的妊娠母猪进行返饲，能够及时地减少损失。这一观点也与Olanratmanee E[11]得出的结果相符合，用7 201头母猪在产前不同时期进行返饲，其中返饲对妊娠61～90 d母猪的流产率最低。

刘秋菊[6]用16头60日龄左右的仔猪做攻毒试验中，仔猪IgG抗体在攻毒后第16天达到最高，其检测OD均值为1.0左右。根据图3所示，在攻毒后第42天母猪的血清IgG抗体OD均值为0.98，尽管在PEDV防治措施中，主要靠肠道的黏膜免疫（IgA抗体），但初乳中若含有较高滴度的IgG抗体，对仔猪同样具有保护作用[12]，由此推出：母猪在返饲后的第11～42天，初乳中的抗体对哺乳仔猪有一定的保护作用，为了延长返饲后抗体保护时间，可在返饲后30～42 d进行组织灭活苗的加强免疫。

在过去的十年里，泰国也推荐利用返饲来扑灭商业猪群暴发的PED[11]。返饲是一把双刃刀，并不是所有场都适合返饲，必需在配合实验室检测的条件下，确定返饲病料中无猪瘟、伪狂犬与猪蓝耳病病原，才可利用返饲控制PED在本场的流行。

[1] LI Z L,ZHU L, MA J Y, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China[J]. Virus genes, 2012, 45(1)﹕ 181-185.

[2] 简义虎.胡仕凤.李润成,等.湖南省猪流行性腹泻发病情况分析[J]. 猪业科学,2016,33,(11)﹕76-77.

[3] LANGEL S N,PAIM F C,LAGER K M,et al.Lactogenic Immunity and Vaccines for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)﹕ Historical And Current Concepts[J]. Virus research, 2016,226﹕93-107.

[4] LI Z L,ZHU L,MA J Y,et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China[J]. Virus genes, 2012, 45(1)﹕ 181-185.

[5] 张田生.猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ和Taq-Man荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D] .南昌：江西农业大学,2015.

[6] 刘秋菊. 猪流行性腹泻病毒IgG、IgA抗体检测方法的建立及应用[D]. 长沙：湖南农业大学, 2016.

[7] 本刊编辑.加拿大猪流行性腹泻生物安全控制的关键措施[J].猪业科学,2014,31(4)﹕29.

[8] DE ARRIBA M L, CARVAJAL A, POZO J, et al. Lymphoproliferative responses and protection in conventional piglets inoculated orally with virulent or attenuated porcine epidemic diarrhoea virus[J]. Journal of virological methods, 2002, 105(1)﹕ 37-47.

[9] WANG X, NIU B, YAN H, et al. Genetic properties of endemic Chinese porcine epidemic diarrhea virus strains isolated since 2010[J]. Archives of virology, 2013, 158(12)﹕ 2487-2494.

[10] JUNG K, SAIF L J. Porcine epidemic diarrhea virus infection﹕ Etiology, epidemiology, pathogenesis and immunoprophylaxis[J]. The Veterinary Journal, 2015, 204(2)﹕ 134-143.

[11] O L A N R A T M A N E E E, KUNAVONGKRIT A, TUMMARUK P.Impact of porcine epidemic diarrhea virus infection at different periods of pregnancy on subsequent reproductive performance in gilts and sows[J]. Animal reproduction science, 2010,122(1)﹕ 42-51.

[12] [美]齐默尔曼（Jeffrey J.Zimmerman）等主编，赵德明等主译.猪病学[M].10版.北京：中国农业出版社，2014：531.

2017-03-03)

湖南省战略性新兴产业项目，编号2016GK4015

简义虎(1989—)，男，河南信阳人，硕士研究生，1519780050@qq.com；

*通信作者：余兴龙，男，教授，博导，研究方向：畜禽疫病防治，E-mail: 1364263406@qq.com