抗原处理相关转运体基因多态性与疾病相关性的研究进展

王兴童, 陈洪岩, 韩凌霞

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 实验动物与比较医学创新团队, 哈尔滨150069)

抗原处理相关转运体基因多态性与疾病相关性的研究进展

王兴童, 陈洪岩, 韩凌霞

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 实验动物与比较医学创新团队, 哈尔滨150069)

抗原处理相关转运体(TAP)是一种异二聚体跨膜转运蛋白，具有高度多态性，主要功能是将胞质中加工产生的抗原肽转运到内质网腔，与主要组织相容复合体(MHC) I 类分子组装形成抗原肽—MHCI 复合物后转运至细胞表面，被 CD8+ T 淋巴细胞识别，诱导机体产生细胞免疫应答。某些特定的人类疾病同TAP的多态性相关，包括多种肿瘤疾病、自身免疫疾病和传染性疾病等。本文就实验动物的TAP基因在与疾病相关性方面的比较医学研究进展做一综述。

抗原处理相关转运体(TAP); 多态性; 疾病; 相关性

抗原处理相关转运体(antigen transfer associated process protein, TAP)是由TAP1和TAP2两个亚基形成的异二聚体跨膜转运蛋白, 其主要功能是将胞质中加工产生的抗原肽转运到内质网腔, 与内质网中新合成的主要组织相容性复合体(major histocompatility complex, MHC)I 类分子组装形成抗原肽—MHCI 复合物后转运至细胞表面，被 CD8+ T 淋巴细胞识别，诱导机体产生细胞免疫应答[1]。TAP基因具有多态性，其基因组序列的突变及其调节机制的缺陷可以导致活性下降和表达下调，最终引起病毒性感染或肿瘤等疾病的发生[2]。世界卫生组织人类白细胞抗原(HLA)委员会已经命名了人类的7个TAP1和4个TAP2等位基因[3]。TAP在进化过程中具有保守性, 人、猪、牛以及鼠科动物中的氨基酸同源性达到70%～80%[4]。哺乳动物尤其人类的TAP研究相对较成熟，而无特定病原体(SPF)鸡和鸭是禽类实验动物的代表，在TAP基因多态性与疫病的相关性研究中，具有独特的比较医学意义[5]。本文就TAP 的结构和疾病相关性等方面的比较医学研究进展做一综述。

1 TAP蛋白

1.1 TAP蛋白的结构

不同种属动物的TAP基因均位于MHC 核心区域，但大小和在基因组中的位置各不相同。人类的TAP1 和 TAP2基因位于6p21.3，在MHCⅡ区域的 DQB1 和 DPB1 之间。TAP1 基因长 8.6 kb，TAP2 基因长 10.2 kb，二者相距约 70 kb[6]。TAP蛋白是一种异二聚体三磷酸腺苷(ATP)结合转运复合物，TAP1 和TAP2两个亚基的N端为跨膜区，C端有深入胞质的核苷酸结合域 (NBD)[7]。TAP1和TAP2的跨膜区分别包含10个和9 个跨膜螺旋——TAP1 N端的4个跨膜螺旋和TAP2 N端的3个跨膜螺旋构成核心跨膜区，每个TAP亚基的核心跨膜区可自主招募作为接头蛋白的T A P相关蛋白(Tapasin)(图1)[8]。TAP1和TAP2 C端的6个跨膜螺旋与NBD组成对抗原肽转运十分必要的转运体核心区。TAP1在C末端编码区含有三个特征性基序: Walker A、Walker B和C-loop。Walker A和Walker B形成高度保守的ATP结合盒，三磷酸腺苷(ATP)和其它核苷酸结合到ATP结合盒上，并依赖Mg2+进行水解[2]。Walker A和Walker B之间的6～8个氨基酸组成C-loop, 促进抗原肽的转运[9]。TAP优先转运8～16个氨基酸残基的短肽, 但也可以容纳长达40个氨基酸残基的肽段, 只是转运效率降低[10]。

图1 TAP结构[8]Figure 1 Structure of TAP

1.2 TAP蛋白的作用机制

MHC I类分子提呈的抗原大多是在胞核和胞质中内源性合成的肽, 包括肿瘤抗原、病毒编码蛋白等。抗原递呈时, 肿瘤抗原在抗原递呈细胞(APC)内与泛素结合, 被蛋白酶复合物水解成8～10个氨基酸的短肽, 长度适合的抗原肽结合至位于内质网膜上的TAP胞质侧的抗原结合槽, 激活TAP上的ATP酶, ATP水解释放能量促使TAP二聚体结构发生改变, 跨膜通道开放, 抗原肽随即被转运于内质网腔内, 在Tapasin、钙连接蛋白(calanexin)和钙网蛋白(calreticulin)等分子伴侣的协同作用下与内质网中新合成组装完整的MHCIa/b2m分子上的肽结合槽结合, 形成稳定的MHCI-抗原肽复合物, 分泌至APC细胞表面, 被CD8+T细胞识别并引起免疫应答[11]。TAP分子对HLAI类分子在细胞膜上表达的密度和稳定性起重要作用, TAP分子缺陷或表达降低, 可导致HLA I类分子因没有荷载抗原肽而无法稳定地在细胞表面表达[12,13]。

2 TAP多态性与人类疾病的相关性

肿瘤是体内外各种因素综合作用的结果，是多原因、多阶段、多次突变所致的一类疾病。肿瘤细胞在免疫系统持续选择的压力下，成功逃避了宿主的免疫识别。而主要的抗肿瘤效应淋巴细胞—CD8+T淋巴细胞，不能识别单个的或整个的肿瘤抗原分子，只能识别由HLA I类分子提呈的抗原肽。因此，肿瘤细胞表面HLA I类分子表达异常可以导致肿瘤细胞免疫原性低下，从而逃避机体的免疫杀伤，这是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一。在肿瘤发生和病毒性感染同时发生时，抗原递呈相关基因的表达和功能都有可能受到影响，包括TAP1和TAP2、Tapasin、MHCI类分子等。人为给瘤细胞直接转导/转染MHCI重链基因，结果尽管胞内MHCI重链的mRNA含量增加，细胞表面I类分子的表达并不能逆转[14]。

TAP基因的缺失或突变可能导致TAP表达下降或功能障碍，而TAP功能障碍或表达下降都将导致肿瘤抗原不能被有效地转运，致使肿瘤逃逸免疫监视[15]。人类鼻咽癌与种族易感性(黄种人较白种人患病多)、遗传因素及EB病毒感染等有关。鼻咽癌标本中的TAP1、TAP2和HLAI的表达低于健康标本[16]。鼻咽癌组织中TAP1的阳性表达率为44.83%(26/58)，极显著(P<0.01)低于慢性鼻咽炎组织中的70.00%(14/20)[12]。原发性黑色素瘤切除标本中，抗原处理相关分子中仅有TAP1(P=0.026)和TAP2(P=0.42)的下调与肿瘤转移进程高度相关[17]。而且，TAP表达与肿瘤低分化程度和恶性呈正相关，如对53例乳腺癌样本HLA I和TAP表达检测表明，16例低度恶性期(G1)切片TAP1、TAP2、HLA I染色均呈强阳性，而37例高度恶性期(G2/3)标本中仅有12例(32%)染色阳性[18]。

TAP2基因的多态性也与汉族食管癌存在相关性[19]。例如TAP2基因的G379A突变是哈萨克族食管癌的危险因素(P<0.05)，杂合型(G/A)及突变型(A/A)是野生型(G/G)个体患病风险的1.57倍[20]。宫颈上皮内瘤变(CIN)是宫颈癌前病变，由于持续感染人乳头瘤病毒所致，单倍型为mut-wt-wt-wt-wt (TAP多态位点t1135-t1341-t1693-t1993-t2254) 的女性，感染CIN的风险极显著低于单倍型为wt-wtwt-wt-wt的女性[21]。

由于TAP的结构和功能特点, 有可能成为某些疾病的易感因子[11]。TAP基因可能影响强直性脊柱炎(AS)的易感性。Feng等[22]调查了中国AS患者TAP1和TAP2基因多态性, 结果表明TAP1第1910位等位基因G的基因型为AG，和TAP2第1693位的基因型AA，能增加b27阴性患AS的风险(P<0.05)。TAP1* 020101的GGGGG和TAP1 *0101-TAP2 * 0102的GGAGG-GAG增加GGGGG-GAG(TAP1 * 020101-TAP2 *0102)患AS风险(P<0.05)。而GGAGG-GGG型(TAP1 * 0301-TAP2×0101)的患者较少，分析原因可能改变抗原肽的选择和运输是AS的一个潜在发病机制。还有很多自身免疫疾病也同TAP相关，如急性细胞排斥反应等[23]，研究TAP对了解这些疾病的发生机制有很大帮助。

肺结核(PTB)患者中TAP1-2 出现GG纯合子和AG杂合子的频率(3.94, P=0.001)高于对照组的(2.87, P=0.000 1), TAP1-2 突变极显著增加了对结核病(PTB)的易感性, 而野生型A(A/A)可能抗结核感染[24]。TAP基因多态性还可能同伊朗东南部扎黑丹PTB患者具有相关性[25]。TAP与斑秃[26]和麻风病[27]等未知病因的疾病也存在联系。

3 TAP多态性在比较医学研究中的进展

不同种属动物的TAP氨基酸产物呈现高度的同源性，可以用于比较医学研究。例如，犬TAP1和TAP2基因的启动区和编码区也存在多态性，但功能区比其他物种保守。将犬TAP2基因转移到鼠TAP2缺陷细胞系中，检测到MHCI分子表达。为研究犬TAP缺失或等位基因突变与内源性疫病和癌症的关系提供了数据[28]。

火鸡的TAP基因还没有明确鉴定，但是已通过序列分析获得了功能和序列类似的 MDR/TAP基因。鸡TAP2基因与优势表达的MHC经典I类分子a链编码基因BF2紧密相连[1]。鹌鹑TAP基因结构更为复杂，与经典I类分子4个拷贝基因相邻[9]。鸭有TAP1和TAP2两个反向转录的拷贝基因，其中TAP2与MHCI类分子优势表达基因UAA毗邻[29]。

潘章源表明TAP1基因表达量的上调可能与断奶仔猪F18大肠杆菌抗性和免疫应答有关。TAP1基因外显子2 G729A变异位点3种基因型个体的表达结果分析显示: BB基因型个体表达普遍髙于AA型和AB型，在脾、肺、肾、胸腺、淋巴结、十二指肠和空肠组织中，BB基因型TAP1的表达显著高于AA型和AB型(P<0.05)，位点G729A对表达有明显的调控作用，有可能作为一个重要的抗性分子标记[30]。

SPF鸡和鸭是禽类实验动物的代表，其进化程度低于哺乳动物，其TAP基因多态性与疫病的相关性研究，具有更深远的比较医学意义。

中国国家禽类实验动物种子中心根据SPF绍兴麻鸭TAP1和TAP2基因组序列的多态性，已选育成功4个MHC单倍型鸭品系，各品系鸭的TAP1和TAP2基因组序列完全纯合, 分别命名为HBW-B1、B2、B3和B4。

利用鸭疫里默氏杆菌感染B1、B2、B3系和B2/B4杂系鸭，死亡率分别为40%、25%、20%和33.3%; 利用I型鸭病毒性肝炎人工感染，结果表明B2单倍型鸭死亡率(36 %)明显低于其他单倍型(73%～93%)[31]。

利用表达 H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟活载体疫苗免疫HBK-SPF雏鸭，免疫后连续9周的观察中，B3系SPF 鸭的血凝抑制(HI)抗体效价始终显著高于其它3个品系[32]。将不同浓度的鸭瘟病毒(DEV)和抗血清混合接种于B3系和B1系鸭原代鸭胚成纤维细胞(DEF)，结果血清抗体和病毒相同浓度时, B3系DEF出现的CPE比B1的严重，且被检孔的平均病毒拷贝数(8.38×105)大于B1(1.89 ×105)品系。被相同浓度血清抗体中和时，B3系的病毒含量更高，增殖更快(数据未发表)。表明鸭的TAP基因型影响鸭肠炎病毒的复制能力，并且B3系HBK鸭比B1系更敏感。

4 小结与展望

TAP蛋白的进化保守和基因组序列的多态性，以及在免疫应答方面的重要作用，使其在研究肿瘤疾病、自身免疫病和传染性疾病的发病机制等具有不容忽视的地位，利用TAP缺陷小鼠研究肿瘤的免疫逃避机制已得到广泛应用[32]，而较低等的禽类实验动物有可能将为利用TAP基因进行遗传学分型[33]、TAP结构和功能的研究[34]，疫病免疫遗传相关性等方面提供比较医学研究意义。

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Advances in Research on Relationship between Transporter Associate with Antigen Processing Gene Polymorphism and Diseases

WANG Xing-tong, CHEN Hong-yan, HAN Ling-xia
(Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China)

Transporter associate with antigen processing (TAP) is a heterodimer which plays a crucial role in antigen presenting process by transporting endogenous antigen peptide from the cytoplasm to the endoplasmic reticulum where can be bound by the major histocompatibility complex (MHC) class I molecules and further be recognized by CD8+T lymphocyte. Polymorphisms of TAP gene and the expression level of TAP protein are associated with susceptibility to certain specific diseases including tumor, autoimmune disease, viral disease and infectious diseases. Here, some similar comparative medicine researches of TAPs in laboratory animals to diseases associations are reviewed.

Transporter associate with antigen processing (TAP); Polymorphism; Diseases; Association

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0252-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.017

2016-11-30

国家科技支撑计划(2015BAI07B02-02), 中国农业科学院基本科研业务费专项(Y2016PT41), 中国农业科学院基本科研业务费专项(302016013)

王兴童(1991-), 女, 硕士研究生, 主要从事兽医微生物和免疫学方面的研究。E-mail: 827203295@qq.com

韩凌霞。E-mail: hanlingxia@caas.cn