紫花苜蓿高频体胚发生及萌发成苗技术与转基因应用

温之雨，董福双，张华宁，杨瑞娟,2，张艳敏

(1.河北省农林科学院 遗传生理研究所，河北省植物转基因中心，石家庄 050051；2.河北师范大学 生命科学学院，石家庄 050024)

紫花苜蓿高频体胚发生及萌发成苗技术与转基因应用

温之雨1，董福双1，张华宁1，杨瑞娟1,2，张艳敏1

(1.河北省农林科学院 遗传生理研究所，河北省植物转基因中心，石家庄 050051；2.河北师范大学 生命科学学院，石家庄 050024)

以紫花苜蓿的子叶或叶片为外植体，建立高频体胚发生及成苗技术体系，为苜蓿耐逆性状的遗传改良提供技术支撑。在愈伤诱导、体胚诱导、体胚成熟与萌发等几个关键环节，分析比较培养基组分对培养效果的影响。建立在SHDK培养基上诱导愈伤、MB(-/+)+ABA 0.4 mg/L+PEG-6000 50 g/L+蔗糖50 g/L培养基上诱导体胚、Bio2Y培养基上促体胚发育成熟、1/2 MS(或SH)培养基上体胚萌发成苗的高频再生技术体系。最适条件下，每克胚性愈伤组织可产生77.9个正常萌发成苗的健康体胚。再生植株在生长箱内经过2周20 ℃、16 h/d的光照培养后移栽温室，成活率达90%以上。利用该离体再生技术成功地将凝集素基因PPA导入苜蓿中，获得抗蚜转基因苜蓿。

紫花苜蓿；体胚发生；离体再生；转基因

苜蓿(MedicagosativaL.)是重要的豆科牧草，营养丰富，蛋白质质量分数占其干物质的17%～20%，被誉为“牧草之王”。种植苜蓿对改良土壤、保持水土及保护环境亦大有益处。中国人口众多，保障粮食生产的任务艰巨；为保证粮食生产的耕地面积，发展苜蓿必须向盐碱滩涂要空间。虽然苜蓿表现出一定的耐盐性，可在轻度盐碱土壤上生存，但尚缺乏可耐中重度盐碱的种质资源。培育强耐盐苜蓿新品种对开发利用盐碱滩涂地及增加苜蓿生物产量具有重要作用。

耐盐苜蓿资源短缺，再加上苜蓿杂交育种困难，利用转基因技术改良苜蓿的耐盐性是加快苜蓿新品种选育的有效途径。苜蓿转基因植株的获得主要由农杆菌介导法[1-5]。大多数的转化技术依赖于苜蓿的组织培养和离体再生，极少利用茎尖建立的in planta转化方法[6]。盛慧等[7]的报道虽然没有经过愈伤诱导过程，但用子叶节为受体通过丛生芽发生途径也没有摆脱组织培养的束缚。因此，建立高效的苜蓿离体再生技术体系是苜蓿遗传转化的重要组成部分。苜蓿的离体再生途径包括器官发生和体胚发生2种途径[8]。其中，体胚发生再生途径因胚状体起源于单细胞，具有嵌合体少、遗传背景一致的优点；胚状体具有的双极性使其可发育成同时具有芽和根的完整植株，避开不定芽发育中的生根困难问题。遗传转化体通过体胚发生途径直接成苗可降低转化细胞的无性变异风险及非转化细胞的逃逸选择风险[9]。但体细胞胚胎再生途径存在培养周期长、分化频率偏低、组织培养条件要求严格等弊端，这些因素限制紫花苜蓿遗传转化效率的提高。王成龙等[10]探索紫花苜蓿的丛生芽再生系统，使其再生频率比体胚再生系统提高1倍，进一步分析发现，丛生芽再生系统与体胚再生系统的芽分化率相差不大(分别为70.4%和67.1%)，差别主要是单个外植体分化的芽数，前者为8.11，后者为2.83。虽然该系统可在相对较短的时间内获得大量的丛生芽，但其存在的高畸形芽率也不容小觑。

植物细胞全能性赋予每个细胞发育成完整植株的可能性，但实际上并非每一个细胞都能被有效诱导发育成小植株，它与细胞的组织来源及生理状态等有关。在小麦、玉米、大豆、棉花等多种作物上都报道组织培养的基因型依赖性[11-15]。在苜蓿上也有基因型影响紫花苜蓿愈伤组织和体胚形成的报道[16-17]。克服这一困难的方法之一是选择再生频率高的基因型，但由此产生的问题是影响转基因作物的实用性或延迟转基因作物的生产应用。本研究以生产用苜蓿品种为材料，从愈伤诱导、体胚诱导、体胚成熟与萌发等几个关键环节入手，进行较为系统的研究，旨在解决苜蓿体胚诱导效率及萌发效率的双低问题，从而建立紫花苜蓿高频体胚发生的离体再生技术，为苜蓿的遗传转化提供良好的受体转化系统。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为紫花苜蓿品种‘三得利’的无菌苗。

1.2 外植体准备

先将苜蓿种子用φ=70%的乙醇消毒1～2 min，再用1 g/L的氯化汞消毒10～12 min，无菌水充分冲洗3～4遍。将种子放到铺有灭菌滤纸的平皿内，用镊子转接到1/2 MS培养基上。在25 ℃、16 h/8 h光暗周期、2 000 lx光照强度下培养7～10 d。然后将外植体按子叶、叶柄、茎段和下胚轴等分开，每一外植体约3 mm大小。

1.3 所用培养基及培养条件

以SH[18]、MS[19]及Bio2Y[20]等为基础培养基，附加不同种类及浓度的激素分别用于愈伤诱导、体胚诱导与成熟及体胚萌发成苗。各阶段所用培养基的组分详见表1；培养基的pH用KOH调节到5.8。 所有培养物都在(25±2) ℃的培养室内进行培养，除愈伤诱导阶段无光照外，其他各阶段维持16 h/d的光照条件。

表1 苜蓿体胚诱导各阶段所用的培养基Table 1 Media used in different periods during embryo induction and maturation

1.4 正交试验优化体胚诱导培养基

以MB(-/+)为基础培养基，以ABA、AgNO3和PEG-6000为效应因子，进行L9(34)正交设计。上述3因子的试验水平分别为0、0.2和0.4 mg/L；0、10和20 mg/L；0、25和50 g/L。将SHDK培养基上诱导的胚性愈伤转移到上述相应培养基上，每处理1瓶，5次重复。用接种后的(瓶+愈伤)质量减去接种前的瓶质量得到每瓶的愈伤质量。20 d后将体胚转移到1/2 SH或1/2 MS培养基上，2周后调查芽和根发育健全、可正常萌发成苗的体胚数，计算各处理每克愈伤组织形成可正常萌发的体胚数。

1.5 凝集素基因PPA转化苜蓿

1.5.1 转基因植株的获得 外植体为生产用苜蓿品种‘三得利’的无菌苗子叶，农杆菌株为携带抗蚜PPA基因的EHA105。抗蚜基因PPA来源于掌叶半夏，构建在带有卡那霉素抗性标记的PBI121质粒载体上，并由35S启动子控制。遗传转化采用外植体预培养和共培养各为3 d的方式[21]。共培养结束后，将外植体转移到恢复培养基(SHDK+头孢噻肟钠500 mg/L)上暗培养7 d。然后转入筛选培养基(成分同恢复培养基，添加卡那霉素30 mg/L)，经过2～3次继代培养获得抗性愈伤组织。将浅黄绿色、粘稠并带有颗粒状结构物的愈伤组织转移到附加有ABA 0.4 mg/L和PEG-6000 50 g/L的体胚诱导培养基MB(-/+)上诱导体胚形成；在Bio2Y+50 g/L蔗糖培养基上促体胚发育成熟；在MS或1/2 MS培养基上促体胚萌发成苗。再生植株在光照培养箱内经过2周25 ℃、16 h/d的光照培养后移栽温室。

1.5.2 PCR、RT-PCR和PCR-Southern检测 植物基因组DNA的提取采用CTAB法。植物总RNA提取用上海华尧/华舜公司的RNArose。PCR扩增PPA基因的上游引物序列为：5′-ATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC-3′，下游序列为：5′-CTACGCGGCAATTGGGCGCTT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应所用TAQ酶、dNTP等试剂购自北京天根生化公司，RT-PCR反应所用试剂为TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0。Southern blot采用ROCHI公司生产的Dig High Prime Labeling and Detection Starter Kit I，根据产品说明书进行操作。

2 结果与分析

2.1 外植体来源对愈伤状态的影响

子叶、叶柄、茎段、下胚轴等4种外植体在SHDK培养基上的愈伤诱导率差异不大，均可达到95%以上；但不同外植体对愈伤诱导表现出不同的时间响应和质量效果。下胚轴切段最先愈伤化，其次是叶柄、子叶，茎段反应最慢。在愈伤继代过程中，茎段来源愈伤最易褐化死亡，淘汰率最高，其次是下胚轴来源愈伤，子叶和叶柄来源的愈伤状态最好。下胚轴来源愈伤增殖速度较快，颜色较浅，分散性较强，不易分化体胚；子叶来源愈伤较易形成浅黄绿色、粘稠糊状并嵌有颗粒状物的胚性愈伤组织，体胚分化率较高，是比较理想的外植体来源。

2.2 培养基对体胚诱导效果的影响

挑选在SHDK培养基上获得的浅黄绿色、粘稠并有颗粒状结构物的愈伤组织转移到体胚诱导培养基上，培养1周后，在MSBN培养基上的愈伤组织表面就陆续出现绿色的球状突起，并很快形成较硬的“盖”覆盖愈伤，没有体胚发生(图1-a)。在MS0和MB(-)培养基上的愈伤组织，在培养2～3周后，肉眼可观察到有体胚发生。MB(-)培养基的体胚诱导效果好于MS0(图1-b,1-c)。MS0培养基上体胚数量较少，不仅发生体胚的愈伤块数少，每块愈伤上面形成的体胚数也少。MB(-/+)培养基[在MB(-)基础上KNO3加倍]的体胚诱导效果较好，每一块愈伤组织都有体胚形成，且愈伤组织内部到后期亦有体胚形成；体胚数量也较其他3个处理明显增加(图1-d)，每克愈伤组织形成的体胚数平均为39.5±6.2。

A.MSBN培养基 MSDN medium; b.MS0培养基 MS0 medium; c.MB(-)培养基 MB(-) medium; d.MB(-/+)培养基 MB(-/+) medium

图1 不同培养基上的体胚诱导效果
Fig.1 Somatic embryo induction on different media

2.3 体胚成熟与萌发

将子叶型胚直接转移到MS0或1/2 MS培养基上后，大部分体胚不能正常萌发成苗。部分胚状体子叶异常膨大后停止生长，或出现连体的子叶，或出现试管苗的玻璃化，或出现大量次级体胚，不能发育成完整的植株；有的胚状体膨大后出现脱分化重新愈伤化现象。据2个批次试验的调查统计，体胚正常萌发成苗的比率仅为5.8%(表2)。

为此，借鉴黎茵等[22]的方法，添加一个体胚成熟的液体培养过程，即将获得的体胚放入促进体胚成熟的液体培养基(SH基本盐+L-Proline 3.45 g/L+(NH4)2SO41.65 g/L+蔗糖20 g/L)中，100 r/min震荡培养5～7 d，然后挑选发育正常的体胚转移到1/2 MS或1/2 SH固体培养基上进行萌发培养，2周后调查体胚萌发率。由表3可见，增加这一促体胚成熟的液体培养过程，对提高体胚的正常萌发率效果并不明显。

表2 未经体胚成熟培养过程的体胚发育情况Table 2 Development of somatic embryos without maturity promotion treatment

注： * 数据为2批次试验“平均数±标准差”。

Note: Data marked with * represents average value and stand division of shoot percentage for Exp.1 and Exp.2.

表3 经过液体体胚成熟培养过程的体胚萌发情况Table 3 Development of somatic embryos after maturity promotion in liquid medium

因此，本研究又以ABA、AgNO3和PEG-6000为效应因子进行L9(34)正交试验优化体胚诱导条件。结果表明，在体胚诱导培养基中添加AgNO3、PEG、ABA等对以后体胚萌发的影响效果不同(表4)。PEG-6000的效应值最大，硝酸银为负效应。最后确定合适的体胚诱导培养基为MB(-/+)+ABA 0.4 mg/L+PEG-6000 50 g/L+蔗糖50 g/L+琼脂4.5 g/L，pH 5.8。最适条件下，每克胚性愈伤组织可产生77.9个正常(或健康)体胚。

将诱导的体胚适时转移到Bio2Y培养基上进行10～14 d的促发育培养，可减少MB(-)培养基上时间太长引发的球形胚重愈伤化现象，从而进一步提高体胚的正常萌发率。最终建立体胚高频发生、正常萌发的苜蓿离体再生技术体系，即：SHDK培养基上诱导愈伤，MB(-/+)+ABA 0.4 mg/L+PEG-6000 50 g/L+蔗糖50 g/L培养基上诱导体胚，Bio2Y培养基上促体胚发育成熟，1/2 MS(或SH)培养基上体胚萌发成苗。再生植株在光照培养箱内经过2周20 ℃、16 h/d的光照培养后移栽温室，成活率90%以上。体胚萌发、再生植株移栽前炼苗及温室移栽情况见图2。

表4 AgNO3、PEG和ABA对苜蓿健康体胚诱导的效应比较[L9(34)]Table 4 Effect of AgNO3,PEG and ABA on the induction of somatic embryos in alfalfa

A.培养基上体胚萌发情况 Embryo germination on medium；b.光照培养箱内炼苗 Plantlets acclimatization in growth cabinet；c.温室内移栽成活 Plantlets grown in soil

图2 再生植株的成苗与移栽
Fig.2 Formation and transplanting of plantlets

2.4PPA抗蚜基因转化苜蓿

共侵染经预培养3 d的子叶50枚，在含有30 mg/L卡那霉素的SHDK培养基上获得抗性愈伤组织23块，抗性愈伤获得率为46%。抗性愈伤在含有15 mg/L卡那霉素的体胚诱导及体胚萌发培养基上培养后获得16个再生植株。再生植株经练苗后移栽温室成活9株。经PCR(图3-a)、PCR-Southern(图3-b)鉴定8株为阳性，表明外源PPA基因已整合进苜蓿基因组。RT-PCR结果表明，外源PPA基因可在转录水平正常表达(图3-c)。

A.转PPA基因苜蓿的PCR方法检测 Detection ofPPAgene in transgenic alfalfa by PCR method; b.转PPA基因苜蓿的PCR-Southern鉴定 Identification ofPPAgene in transgenic alfalfa by PCR-Southern method; c.转PPA基因苜蓿在转录水平的表达检测 Detection ofPPAgene expression at the transcription level in transgenic alfalfa.

P1～P9.转化再生植株 Plantlets regenerated from transformation; CK-.阴性对照 Negative control without transformation; CK+.阳性对照 Positive control plant; CK2.P9植株经DNase I 消化后的RNA样品，以排除样品未消化干净的DNA样品干扰 RNA sample from plant P9 digested with DNase I to verify if the DNA contamination was eliminated.

图3 转PPA基因苜蓿的分子鉴定
Fig.3 The identification ofPPAtransgenic alfalfa by PCR,PCR-Southern and RT-PCR methods

3 讨 论

紫花苜蓿的愈伤诱导多以MS、UM、SH等为基础培养基附加不同种类和浓度的植物激素[10,23-24]。激素中2,4-D作用最为显著，其单独使用或与其他细胞分裂素组合，都能成功地诱导出愈伤组织。不同的2,4-D浓度，诱导的愈伤组织结构形态差异很大，不同外植体来源的愈伤组织生长所需的激素种类和浓度也不同[25]。本研究采用SH为基础培养基，比较容易地诱导出呈粘稠、微黄绿色、具结构性内容物的胚性愈伤组织。困难的是体胚，特别是“健康”体胚的诱导和成熟。只有“健康”的体胚才可最终发育成完整的植株。

4 结 论

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

High Frequency of Embryogenesis and Germination to Seedling in Alfalfa and Its Application in Transgenic Research

WEN Zhiyu1,DONG Fushuang1,ZHANG Huaning1,YANG Ruijuan1,2and ZHANG Yanmin1

(1.Institute of Genetics and Physiology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province,Shijiazhuang 050051,China；2.College of Life Science,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024,China)

The objective of this study was to establish the technique for high efficient embryogenesis and seedling development using cotyledons or leaves from aseptic seedlings as explants,which will provide a technical support for genetic improvement of tolerance to abiotic stresses in alfalfa(Medicagosativa).The effects of different medium ingredients on callus induction,embryogenetic induction,maturation,and germination were compared.The technique for high-frequency of embryogenesis included induction of callus on SHDK medium,induction of embyros on MB(-/+) + 0.4 mg/L ABA+50 g/L PEG-6000+50 g/L sucrose,growth of embryos on Bio2Y medium,and development of seedling on 1/2 MS(or SH) medium.Under the optimal conditions,about 77.9 healthy embryos that formed seedlings were produced per gram of callus.The seedlings regenerated were grown in a growth chamber at 20 °C with a photoperiod of 16 h light and 8 h dark for two weeks prior to transplanting to a greenhouse,and the survival rate was over 90%.This technique was successfully used in the transformation ofPPAgene into alfalfa and the transgenic alfalfa with resistance to aphid was obtained.

MedicagosativaL; Somatic embryogenesis; In vitro regeneration; Transgene

2016-03-18 Returned 2016-04-19

The Natural Science Foundation of Hebei Province,China(No.C2013301033).

WEN Zhiyu,male,associate research fellow.Research area: crop resources innovation.E-mail: wzy1800@126.com

ZHANG Yanmin,female,research fellow.Research area: tissue culture and transgenic technology.E-mail: zhym63@163.com

日期：2017-06-05

2016-03-18

2016-04-19

河北省自然科学基金(C2013301033)。 第一作者：温之雨，男，副研究员，主要从事农作物资源创新研究。E-mail: wzy1800@126.com 通信作者：张艳敏，女，研究员，主要从事组织培养与转基因技术研究。E-mail: zhym63@163.com

S512.1+2

A

1004-1389(2017)06-0882-08

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