冰梨酒酿酒酵母的筛选

赵国群，张晓腾，赵一凡，关军锋*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省农林科学院遗传生理研究所，河北石家庄050051）

冰梨酒酿酒酵母的筛选

赵国群1，张晓腾1，赵一凡1，关军锋2*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省农林科学院遗传生理研究所，河北石家庄050051）

以鸭梨为原料，榨汁后经冷冻浓缩制成浓缩梨汁（即冰梨汁），接入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在15℃下进行低温酒精发酵酿制成冰梨酒。通过比较8株酿酒酵母的发酵性能，及其所酿冰梨酒的理化指标、有机酸含量和感官品质，最终确定酿酒酵母R2为酿制冰梨酒的适宜菌种。该酵母生长繁殖快、降糖和产酒精能力强、发酵性能优良；酿出的冰梨酒酒香和谐，果香纯正，口感甜美醇厚、柔和爽口，具有冰梨酒特有的风味。

冰梨酒；酿酒酵母；酒精发酵；筛选

冰酒一般是指推迟鲜果采收时间，将其在自然低温（-7～-10℃）条件下冰冻，然后采摘、榨汁、发酵酿成的果酒。《中国葡萄酿酒技术规范》中对冰葡萄酒的定义是：将葡萄推迟采收，在气温低于-7℃条件下，使葡萄在树枝上保持一定时间，使其结冰，然后采收、压榨，用此葡萄汁酿成的酒[1-2]。冰葡萄酒由于其独特浓郁的醇厚甜香风味和口感，加上对原料的苛刻要求和繁复、严谨、漫长的发酵过程使其成为葡萄酒中的极品，更被誉为“液体黄金”[3]。借鉴冰葡萄酒的概念和酿造工艺，采用人工冷冻技术，其他果实酿制的冰酒也有了很大的发展，并已经开发出蓝莓冰酒[4]、树莓冰酒[5]、沙棘冰酒[6]和荔枝冰酒[7]等。梨果肉质细脆，含糖量高，香甜爽口，营养丰富，含有各种蛋白质、矿物质和多种维生素等，是酿造果酒的良好原料[8]。但目前鲜有冰梨酒的报道。

冰酒原料的高糖、高酸环境以及发酵过程中低温条件要求所采用的酵母能耐高糖、耐低温。酵母种类对冰酒发酵过程中乙酸和甘油的形成、冰酒的感官特性有显著影响。由于高渗环境引起酵母菌的胁迫，3-磷酸甘油脱氢酶1（glycerol phosphate dehydrogenase，GPD1）和3-磷酸甘油酯酶2（glycerol phosphatase，GPP2）在短时间内诱导表达，促使代谢流转向甘油合成途径并在胞内积累以平衡外界渗透压，高渗透压也正向调节酵母菌乙醛脱氢酶活性，促使乙酸的合成，因而冰酒中甘油和乙酸含量比普通酒多[9-10]。甘油能改善改善葡萄酒的甜味、酒体与丰满度[11]。乙酸约占冰酒中挥发酸的90%，高挥发酸会使冰酒出现腐败味，降低冰酒的价值[12]。国内外学者对冰葡萄酒酿造菌种进行了筛选。ERASMUS D J等[13]比较了7种商品酿酒酵母的发酵性能，发现菌株R-HST、N96和EC1118产乙酸量少，适合冰葡萄酒的生产；裴广仁等[14]比较了9种商业葡萄酒酵母，发现菌株WY3最适合冰葡萄酒生产。酿酒酵母种类对于冰酒的生产及品质至关重要，目前尚未见冰梨酒专用酵母的报道。本研究以鸭梨为原料，榨汁后经冷冻浓缩制成浓缩梨汁，接种酿酒酵母后在低温条件下进行酒精发酵，比较不同的酿酒酵母的发酵性能及冰梨酒的理化指标和感官品质，以期筛选出一株适合于酿造冰梨酒的酿酒酵母。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸭梨：河北省赵县产；耐低温酿酒酵母R2、R-HST、EC1118、K1、DV10、71B：上海杰兔工贸有限公司；酿酒酵母RW：湖北安琪酵母股份有限公司；酿酒酵母KD10：本实验室保存。酵母粉、葡萄糖、蛋白胨等生化试剂：北京奥博星生物技术有限责任公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液体培养基：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉。

1.2 仪器与设备

JYZ-E6螺杆式榨汁机：九阳股份有限公司；ZXSD-A1090生化培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；安捷伦6820高效气相色谱仪：美国惠普公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酿酒酵母种子液的制备

酿酒酵母R2、R-HST、EC1118、K1、DV10、71B、RW：配制5%的葡萄糖水，以100∶1（mL∶g）比例加入干酵母粉，35℃下活化30 min。

酿酒酵母KD10：在100 mL YPD液体培养基中，接入2～3环斜面保藏的酵母菌株，在30℃、180 r/min摇床培养12 h。

1.3.2 冰梨汁的制备

选择新鲜无病的成熟鸭梨，清水洗净、去核后榨汁。利用不同浓度溶液的冰点不同，溶液浓度越低冰点越高，即先结冰部分溶液较稀，去除冰晶可将溶液浓缩的原理，将压榨后的鸭梨汁放置于-18℃冰箱冷冻室中冷冻至完全结冰，然后在4℃冷藏室中进行解冻，去除冰块，收集先溶解的部分果汁，并测定可溶性固形物含量，再放入冷冻室冷冻，然后解冻，如此重复多次，最后获得浓缩的鸭梨汁，即为冰梨汁。经测定，冰梨汁中还原糖含量360 g/L、总酸含量3.75 g/L。

1.3.3 冰梨酒的发酵

将300 mL冰梨汁加入500 mL的三角瓶中，加入360 μL 100 g/L偏重亚硫酸钾溶液（SO2终质量浓度60 mg/L），接入酿酒酵母种子液，接种量均为1×106CFU/mL，用8层干净的纱布封口，在15℃生化培养箱中静置，进行酒精发酵。定时测定发酵液中的活菌数、还原糖含量和总酸。待发酵液酒精含量约12%（体积分数）时，补180 μL 100 g/L偏重亚硫酸钾溶液终止发酵。发酵结束后，用硅藻土过滤，所得到的澄清酒液即为冰梨酒，装瓶后冷藏。检测冰梨酒的理化指标及有机酸，并对冰梨酒的感官品质进行评价。

1.3.4 分析方法

（1）发酵液酵母活菌数的测定

采用平板菌落计数法测定发酵液酵母活菌数[15]。

（2）冰梨酒理化指标测定

冰梨酒的常规理化指标参照GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》进行测定。有机酸的测定：高效液相色谱法[16]；还原糖的测定：3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[17]；色度的测定[18]：冰梨酒经0.45 μm孔径的滤纸过滤，置于1mm的比色杯中，在波长420nm、520nm和620nm处测定其吸光度值，分别记作A420nm、A520nm和A620nm，三者相加即为该冰梨酒色度。

（3）冰梨酒的感官评价

挑选10位具有食品评审经验的师生组成评审小组，评分标准参照冰葡萄酒国家标准GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中的规定，主要从外观色泽、澄清度、香气、口味、风格几方面进行评定，满分100分，感官得分以平均值计。具体感官评价标准见表1。

表1 冰梨酒的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standards of ice pear wine

2 结果与分析

2.1 不同酵母发酵性能比较

2.1.1 生长能力

冰酒发酵过程中，发酵启动时间过长，将会加大发酵醪感染杂菌的机会，并影响发酵设备的利用率，这就要求所使用的酿酒酵母在高糖、高酸及低温条件下有较强的生长能力。一般冰葡萄汁含糖量320～360 g/L、总酸80～120 g/L[19]，而本研究所使用的冰梨汁糖含量360 g/L、总酸含量3.75 g/L，因此，冰梨汁仅是高糖而非高酸环境。对8株酵母菌株的生长能力进行检测，结果见表2。由表2可知，8株酵母菌接种到冰梨汁后，由于受到低温和高糖环境的影响，酵母细胞生长总体比较缓慢，但不同酵母菌株的生长能力仍有明显的差异（P＜0.05）。菌株EC1118和K1在发酵6 d时活菌数达到最大值，而其余菌株在4 d时即达到最大值。菌株DV10的最大活菌数最高，为32.7×107CFU/mL；而菌株71B最大活菌数最低，仅为13.4×107CFU/mL，这表明菌株DV10耐低温、耐高渗的能力最强。从酵母菌体总的生长性能进行比较可知，菌株DV10生长能力最好，其次为菌株R2、K1。

表28 株酵母菌的生长能力比较Table 2 Comparison of the growth ability of eight yeast strains

2.1.2 降糖及产酒精能力

比较8株酵母发酵冰梨汁第14天时的残糖含量及酒精度，结果见表3。由表3可知，不同酵母菌株的降糖能力和产酒精能力有着较大的差异。菌株DV10降糖速度最快，所产生的酒精最多，表明该菌株在低温和高渗条件下代谢转化糖的能力和产酒精能力均较强；其次是菌株R2、RW。从表3还可看出，尽管发酵结束时冰梨酒的酒精度均达到12%vol，满足了GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》对冰酒酒精度的要求，但8株酵母的发酵周期明显不同。菌株DV10的发酵周期最短，仅为14 d，其原因可能与该菌株生长速度快、降糖和产酒精能力强有关；而菌株71B的发酵周期最长，达26 d。从降糖速度、产酒精能力和发酵周期角度综合考虑，酵母发酵能力从强到弱依次为DV10＞EC1118＞R2。

表38 株酵母菌的降糖及产酒精能力比较Table 3 Comparison of the sugar-reducing and alcohol-producing capacity of eight yeast strains

2.1.3 产酸能力

果酒中的有机酸与果酒的风味有很大的关系，其不仅保持果酒的果香、降低甜度，还可以修饰其他的滋味[20]。梨汁本身含有苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎宁酸、莽草酸、乳酸等多种有机酸。酿酒酵母在酒精发酵过程中不仅会将糖转化为酒精，而且在其生长代谢过程还会产生苹果酸和琥珀酸等有机酸[16]。对8株酵母菌株的产酸能力进行检测，结果见表4。由表4可知，与未发酵的冰梨汁（总酸3.75 g/L）相比，冰梨酒的总酸大幅度增加；其中菌株R-HST发酵的冰梨酒总酸最高，达到7.50g/L，是冰梨汁总酸的2倍，而其他7株酵母发酵的冰梨酒总酸含量很接近，约为冰梨汁的1.7倍，表明这8株酵母菌均有较强的产酸能力，其中产酸最强的是菌株R-HST。

表48 株酵母菌的产酸能力比较Table 4 Comparison of acids-producing capacity of eight yeast strains

挥发酸是影响冰酒口感的重要影响因素之一，其主要化学成分是乙酸。适量的挥发酸可以增加冰酒酒体的醇厚，但是过量的挥发酸会严重影响冰酒的酒质与口感，甚至有令人不愉快的气味产生[21]。普通葡萄酒中乙酸的阈值是0.2 g/L，最适浓度为0.2～0.7 g/L，在此范围内乙酸可以增强葡萄酒香气的复杂性，但超过0.7 g/L后，会对葡萄酒的香气产生负面影响[22]；而冰葡萄酒中乙酸的阈值是3.18 g/L[23]。由表4可知，与未发酵的冰梨汁（挥发酸0.023 g/L）相比，冰梨酒挥发酸含量急剧增加，达到58倍以上；挥发酸中主要是乙酸，占挥发酸的95%以上。其中，菌株DV10发酵的冰梨酒中挥发酸含量最高，其次是菌株71B，而其他酵母所产挥发酸量很接近。高含量的挥发酸是冰酒酸败的标志，国家标准GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中规定冰酒挥发酸的限量为2.1 g/L。实际上，冰酒的高挥发酸通常是由于酵母对高渗胁迫的反应，而不是细菌的腐败作用[14]。尽管发酵后冰梨酒中乙酸含量大幅度增加，但挥发酸含量范围为1.35～1.51g/L，均符合GB/T25504—2010《冰葡萄酒》中规定的冰酒挥发酸限量。裴广仁等[14]筛选冰葡萄酒酿酒酵母时，发现供试酵母发酵的冰葡萄酒挥发酸含量为0.87～1.56g/L，与本试验结果基本一致。

2.2 不同酵母发酵的冰梨酒质量指标比较

2.2.1 冰梨酒的理化指标

对8株酵母菌发酵的冰梨酒理化指标进行检测，结果见表5。由表5可知，菌株R2和R-HST所酿冰梨酒的酒精度低于其他6株菌，但其还原糖含量较高。菌株R-HST所酿冰梨酒的总酸最高，达到了7.50 g/L；其他7株的总酸差异不显著。就冰梨酒的挥发酸含量而言，不同酵母菌所酿冰梨酒差异较大；菌株DV10和71B的挥发酸含量较高，而菌株R2、R-HST和KD10的挥发酸含量较低。8株酵母菌所酿冰梨酒的pH值差异不显著。葡萄酒的主体骨架是由干浸出物含量决定的，干浸出物含量越高，葡萄酒品质越好。菌株R2和71B所酿制的冰梨酒干浸出物显著高于其他菌株。8株菌所酿制的冰梨酒在色度上有明显的差异。菌株DV10酿制的冰梨酒色度值最高（0.65），其次是菌株EC1118（0.51），而菌株R2酿制的冰梨酒色度值最低（0.33）。8株酵母发酵的冰梨酒颜色为浅黄至褐黄色，这种颜色差异用目测即可察觉出。造成这种现象的原因可能与酵母细胞吸附冰梨酒中酚类物质能力不同有关[24]。从挥发酸、干浸出物和色度的检测结果分析，菌株R2最适宜用来酿制冰梨酒。

表58 株酵母所酿的冰梨酒理化指标Table 5 Physicochemical indexes of ice pear wines brewed by eight yeast strains

2.2.2 冰梨酒中有机酸

有机酸的种类、含量和比例调节着果酒的酸碱平衡，影响着果酒的口感及色泽[25]。对8株酵母菌发酵的冰梨酒中有机酸进行检测，结果见表6。由表6可知，8株菌所酿制的冰梨酒中有机酸总量比较接近。8株酵母菌发酵的冰梨酒中均含有10种有机酸，其中，除菌株DV10外，苹果酸含量均为最高，约占总有机酸的30%左右，其次为乙酸、琥珀酸，这三种酸约占总有机酸的70%左右，是冰梨酒中的三种主要有机酸。菌株DV10产生的乙酸含量最高，达到了1.44 g/L，比菌株R2高7.46%；菌株KD10所酿制的冰梨酒中苹果酸含量最高。乙酸含量低、苹果酸含量高有利于冰梨酒感官品质，因此，从产有机酸的角度考虑，酿制冰梨酒的适宜菌株为KD10、K1和71B。乙酸主要是由酵母代谢产生的，酒石酸、苹果酸、柠檬酸则来自于梨果实。酵母既能代谢消耗有机酸，自身也能产生有机酸[16]。因此，造成不同酵母菌株发酵的冰梨酒中有机酸含量有较大差异。

2.2.3 冰梨酒的感官评价

对8株酵母菌发酵的冰梨酒进行感官评价，结果见表7。由表7可知，8株菌所酿制的冰梨酒澄清度没有差异。在色泽上，由于菌株DV10和EC1118比其他菌株所发酵的冰梨酒色泽更深，呈深褐黄色，因而二者的感官评价得分稍低。8株菌所酿制的冰梨酒感官品质存在一定差异，主要表现在香气和口味上，其中菌株R2的得分最高。在风格上，菌株R2和R-HST得分最高。从感官评价的总分看，菌株R2的感官评分最高。

表78 株酵母所酿的冰梨酒感官评价结果Table 7 Sensory evaluation results of ice pear wines brewed by eight yeast strains

根据上述的试验结果，从生长能力、降糖及产酒精能力的角度考虑，菌株DV10的性能最优，但该菌株所酿制的冰梨酒色泽差，香气和口味也不够好。菌株R2的综合发酵性能仅次于DV10而明显好于其他6株菌，且其感官质量最优。综合考虑，确定酿酒酵母R2为酿制冰梨酒的适宜菌种。

3 结论

本研究以鸭梨为原料，接种酿酒酵母进行低温酒精发酵酿制冰梨酒。通过分析比较8株酿酒酵母的冰梨酒发酵性能，以及所酿制冰梨酒的理化指标、有机酸含量和感官品质，最终确定酿酒酵母R2为酿制冰梨酒的适宜菌种。该酵母生长繁殖快，降糖和产酒精能力强，发酵性能优良；酿出的冰梨酒酒香和谐，果香纯正，口感甜美醇厚、柔和爽口，具有冰梨酒特有的风味。与未发酵的冰梨汁相比，冰梨酒的总酸及挥发酸大幅度增加，且均符合GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中规定的质量标准。为冰梨酒的研究与开发提供一定的参考。

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Screening ofSaccharomyces cerevisiaefor ice pear wine brewing

ZHAO Guoqun1,ZHANG Xiaoteng1,ZHAO Yifan1,GUAN Junfeng2*
(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China; 2.Institute of Genetics and Physiology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

The"Ya"pear,as the raw material,was squeezed and frozen concentrated into pear juice(ice pear juice),and then the concentrated juice was inoculatedSaccharomyces cerevisiaeand alcohol fermentation happened at low temperature(15℃).Through comparing the fermentation performances of eightS.cerevisiaeand the physicochemical indexes,organic acids contents and sensory quality of ice pear wine brewed by eight yeast strains,theS.cerevisiaeR2 was finally identified as the optimal yeast strain for ice pear wine brewing.The strain R2 had the characteristics of rapid growth,strong sugar-reducing and alcohol-producing capacity and excellent fermentation performances.The ice pear wine had sweet and full-bodied tastes with mellow and elegant fruit aroma,and showed typical flavor of ice pear wine.

ice pear wine;Saccharomyces cerevisiae;alcohol fermentation;screening

TS255.47

0254-5071（2017）06-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.016

2017-02-20

国家现代农业[梨]产业技术体系建设专项（cars-29）

赵国群（1963-），男，教授，博士，研究方向工业微生物技术。

*通讯作者：关军锋（1966-），男，研究员，博士，研究方向果品贮藏加工。