翼核果素对肝癌HepG2细胞凋亡及细胞骨架蛋白F-actin的影响❋

刘 瑛,陆国寿,卢文杰,王 丽,黄周锋,胡筱希

(广西中药质量标准研究重点实验室，广西壮族自治区中医药研究院，南宁 530022)



【实验研究】

翼核果素对肝癌HepG2细胞凋亡及细胞骨架蛋白F-actin的影响❋

刘 瑛,陆国寿△,卢文杰,王 丽,黄周锋,胡筱希

(广西中药质量标准研究重点实验室，广西壮族自治区中医药研究院，南宁 530022)

目的:研究翼核果素对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法:以不同浓度的翼核果素作用于体外培养的HepG2细胞，采用MTT法检测细胞生长抑制率，HE、吖啶橙染色观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率和周期，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin形态学变化。结果:翼核果素可明显抑制人肝癌HepG2细胞的增殖且呈剂量依赖性，作用于HepG2细胞24 h的IC50值为124.77 μmol·L-1。显微镜可见细胞核变形、染色体聚集等典型的凋亡形态学改变。流式细胞仪检测结果显示，60、90 μmol·L-1翼核果素给药组细胞凋亡的百分率显著高于对照组，G2/M期细胞比例显著高于对照组，细胞骨架蛋白F-actin呈现解聚断裂状态。结论:翼核果素可抑制HepG2细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与细胞周期阻滞、细胞骨架蛋白F-actin解聚有关。

翼核果素；HepG2细胞；增殖抑制；凋亡；细胞骨架蛋白

广西是肝癌高发区，作为常见病和多发病，肝癌的死亡率占广西恶性肿瘤死亡率的40.04%，严重危害人们的生命健康。目前治疗肝癌的化疗药物大多为细胞毒性药物，易产生耐药性，效果不佳。天然植物来源的抗肿瘤药物因其作用机制独特，抗癌疗效显著，目前已逐步在临床上占据主导地位[1]。

翼核果素(Ventilagolin)提取自广西传统瑶药材紫九牛[2]，是本研究团队首次发现，经结构鉴定属于1,4-萘醌类化合物。研究报道，萘醌类化合物具有良好的抗肿瘤作用[3-5]，但目前针对翼核果素抗肿瘤活性的研究仍是空白。为研究翼核果素对肝癌发生发展的影响，本研究建立了人肝癌HepG2细胞体外模型，通过测定翼核果素对HepG2细胞增殖、凋亡相关生物学指标的变化，探讨其抗肿瘤作用及机制，为其深入开发利用提供一定的实验支撑和理论依据。

1 材料

1.1 细胞株

人肝癌细胞株HepG2购于湘雅医学院细胞库。

1.1.1 药物及试剂 翼核果素由广西中医药研究院化学所提供，紫红色针状结晶，二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 μmol·mL-1储备液，过滤除菌备用；DMEM高糖培养基，博士德公司；胎牛血清、DMSO，Giobco公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，biotopped公司；HE染色试剂盒、吖啶橙染色试剂盒，碧云天生物技术研究所；Annexin V FITC-PI细胞凋亡检测试剂盒，life公司；细胞周期检测试剂盒，联科公司；4%多聚甲醛、Triton X-100，成都科龙化工试剂厂；ActinGreen 488 Reddyprobes reagent染液、DAPI染液，life公司；抗荧光淬灭封片剂，碧云天生物技术研究所。

1.1.2 仪器 二氧化碳培养箱，美国Thermo；全波长酶标仪，美国Thermo；EVOS FL Auto荧光显微镜，美国Life；流式细胞仪，美国BD；高速常温离心机，德国Eppendorf；激光共聚焦扫描显微镜，日本Nikon A1。

2 方法

2.1 HepG2细胞的培养

细胞于37℃、5%CO2培养箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在培养瓶内常规单层传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率

细胞消化计数， 105个/孔接种于96孔板，贴壁生长24 h。加入不同浓度的翼核果素，200、150、100、50 μmol·L-1，每个浓度平行4孔；空白对照组加入等体积的DMEM培养基，溶剂对照组加入相应浓度的DMSO，作用24 h。每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)溶液，培养箱中孵育4 h弃上清，每孔加入100 μL DMSO溶解结晶，酶标仪490 nm检测吸光度OD值，按公式计算细胞生长抑制率(IR)、细胞存活率和半数抑制浓度(IC50)。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值 ×100%。增殖抑制率=1-(实验组OD值/对照组OD值) ×100%。

2.3 HE、吖啶橙染色观察细胞形态

消化细胞5×105个/孔爬片，贴壁24 h后加入不同浓度的翼核果素作用24 h。HE染色弃上清，95%乙醇固定20 min，PBS清洗2次。取出盖玻片，苏木素染色5 min，伊红染色2 min，甘油封片，显微镜下观察。吖啶橙染色弃上清，95%乙醇固定20 min，取出盖玻片，1%醋酸作用30 s，0.02%吖啶橙染色1 min，CaCl2作用2 min PBS漂洗，甘油封片，荧光显微镜下观察。

2.4 FCM检测细胞凋亡率

不同浓度翼核果素作用24 h后收集上清液和细胞，1000 rpm·min-1离心5 min去上清，PBS洗涤，将细胞重悬于100 μl loading buffer至106个/mL。每管加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI混匀，避光孵育15 min，加入400 μL loading buffer混匀，过筛网，流式细胞仪检测细胞凋亡率。同时设置凋亡诱导刺激的荧光补偿组：只加5 μL AnnexinV-FITC；只加1 μL PI；不加任何染料，只加500 μL的loading buffer。

2.5 FCM检测细胞周期

不同浓度翼核果素作用24 h后收集细胞，1300 rpm·min-1离心5 min弃上清，加入1mLPBS重悬洗涤细胞，1 300 rpm·min-1离心5 min弃上清，重复洗涤1次弃上清，加入预冷的75%乙醇4℃固定过夜。1300 rpm·min-1离心15 min弃去固定液，加入1 mLPBS洗涤1次，1300 rpm·min-1离心20 min弃上清，留100 μLPBS重悬细胞，加入10 μL RNasA酶(10 mg·ml-1)，37℃水浴30 min，加入300 μL PI染色，4℃染核30 min过筛网，流式细胞仪检测细胞周期。

2.6 免疫荧光法检测细胞骨架蛋白

取对数生长期的细胞106个接种于共聚焦专用培养皿中，贴壁24 h。加入不同浓度的翼核果素作用24 h。4%多聚甲醛固定20 min PBS清洗，0.2% Triton X-100透化15 min PBS清洗，封闭30 min PBS清洗，ActinGreen 488 Reddyprobes reagent 20-25℃孵育30 min PBS清洗，DAPI避光孵育5 min PBS清洗，抗荧光淬灭封片剂封片。激光共聚焦扫描显微镜采用完美对焦系统动态双向扫描模式，选择激发波长488 nm，发射波长530 nm，激光功率9.0 mW，光电倍增管电压110 V条件下摄图。

3 结果

3.1 翼核果素对HepG2细胞的增殖抑制作用

图1显示，翼核果素在50～200 μmol·L-1浓度范围内对HepG2细胞的增殖有抑制作用，抑制作用随药物浓度的增加逐渐增强，呈剂量依赖性。翼核果素作用于HepG2细胞24 h的IC50值为124.77 μmol·L-1。

图1 不同浓度翼核果素对HepG2细胞的抑制作用，±s

3.2 翼核果素对HepG2细胞形态学的影响

图2显示，细胞经HE染色，空白对照组HepG2细胞呈梭形，胞体大，胞浆丰富，多见核分裂像。经翼核果素作用后HepG2细胞数明显减少，细胞皱缩变细长，胞浆减少，可见明显空泡化，细胞核固缩浓染，可见凋亡小体。

图3显示，细胞经吖啶橙荧光染色，空白对照组HepG2细胞膜完整光滑，细胞核形态饱满呈均匀绿色，染色较浅。经翼核果素作用后HepG2细胞数量减少，胞膜皱缩，细胞核体积相对变小，染色质浓集，荧光明显增强，可见凋亡小体。

图2 翼核果素对HepG2细胞形态的影响(HE×100)

图3 翼核果素对HepG2细胞形态的影响(吖啶橙×100)

3.3 翼核果素对HepG2细胞凋亡和周期影响

表1显示，流式细胞仪检测结果显示，随翼核果素浓度的增加，细胞凋亡率增大，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示翼核果素能诱导HepG2细胞凋亡且呈剂量依赖性。翼核果素作用HepG2细胞后，细胞周期各时相分布有差异，主要表现为G2/M期细胞比例增多，G0/ G1期细胞比例减少，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示翼核果素能将HepG2细胞阻滞于细胞分裂的G2/M期，从而抑制细胞的分裂增殖。

表1 翼核果素对HepG2细胞凋亡和周期的影响

注：与空白对照组比较：**P<0.01

图4 翼核果素对HepG2细胞骨架蛋白F-actin的影响

3.4 翼核果素对HepG2细胞骨架蛋白F-actin的影响

图4显示，Actingreen 488能与细胞内的纤维肌动蛋白F-actin特异性结合，与异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 偶联呈绿色荧光，主要分布在细胞膜和细胞质内。激光共聚焦扫描显微镜下观察，空白组HepG2细胞伸展良好，形状不规则，可见大量毛刺伪足，细胞质内F-actin纤维蛋白呈长条细丝状，结构完整，排列规则，绿色荧光较强。翼核果素作用细胞后，细胞体积缩小，毛刺伪足减少，胞质中F-actin纤维蛋白数量明显减少，丝状结构断裂，排列紊乱，胞浆可见明显空泡化改变，破损的F-actin纤维断裂端呈堆积状，绿色荧光强弱不均。

4 讨论

恶性肿瘤发生和无限发展的关键因素是诸多原因诱发的细胞增殖失控和凋亡受阻[6]，针对这一机制，恶性肿瘤的全新治疗手段是有效地抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡，这也是目前肿瘤治疗的热点和靶点之一[7]。

本研究以人肝癌HepG2细胞为体外模型，观察中药单体翼核果素对肿瘤细胞的影响。结果显示，翼核果素可显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖并呈剂量依赖性；HE染色、吖啶橙染色后荧光显微镜观察到翼核果素给药组细胞出现典型的凋亡改变；流式细胞仪检测发现，翼核果素作用细胞后凋亡率显著高于对照组，HepG2细胞被特异性的阻滞在G2/M期且呈剂量依赖性，证实翼核果素可通过阻滞细胞周期而诱导HepG2细胞凋亡，说明其抑制肿瘤细胞增殖作用可能与诱导细胞凋亡有关。

细胞骨架是由蛋白纤维构成的网络状结构，包括微管、微丝和中间纤维构成的细胞形态和运动协调系统，在细胞生命周期中发挥着重要作用[8-9]，同时与细胞的凋亡、分化等生理功能改变有着密切联系[10-11]。微丝是细胞骨架结构中最细的，主要由肌动蛋白(actin)组成，以游离球状actin(G-actin)和聚合纤维状actin(F-actin)2种形式存在。研究表明，actin是细胞早期凋亡的调控物之一，通过改变actin的稳定状态，触发F-actin的解聚，可以导致细胞凋亡的发生[12-13]。

本实验中翼核果素作用HepG2细胞后，细胞内细丝状的F-actin发生解聚，断裂的F-actin不规则地弥漫堆积在细胞内，原有的游离-聚合之间的动态平衡被打破，最终细胞结构发生改变。细胞结构的形态学改变是细胞凋亡的基础，可以认为翼核果素诱导的F-actin解聚是其抑制HepG2细胞增殖和促凋亡的机制之一。

目前，国内外尚无翼核果素药理活性的相关报道。本研究首次发现，其对HepG2细胞有显著的抑制增殖和促进凋亡的作用，通过对细胞微丝结构的微观形态学观察，初步了解了翼核果素抗肿瘤作用的内在机理。作为一种新颖的有良好活性的抗肝癌中草药提取化合物，其具有很好的应用开发价值，但其抗肿瘤作用机制还有待进一步的深入研究。

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Effects of Ventilagolin On the Apoptosis of Human Hepatoma HepG2 Cells and Cytoskeletal Protein F-actin

LIU Ying，LU Guo-shou△，LU Wen-jie，WANG Li，HUANG Zhou-feng，HU Xiao-xi

(GuangxiKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicaineQualityStardandsGuangxiInstituteofTraditionalMedicalandPharmaceuticalSciences,Nanning530022,China)

Objective: To study the inhibition effects of ventilagolin and proliferation and apoptosis on human hepatocellular carcinoma cells HepG2, discusses the possible mechanisms. Methods: HepG2 cells in culture medium were treated with different concentrations of ventilagolin. The inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay. The morphology of cells was observed by HE and Acridine orange stain. Cell cycle changes and apoptotic rate were detected by Flow Cytometry(FCM). The mophological changes of cytoskeletal protein F-actin were observed by laser confocal microscopy. Results: The growth of HepG2 cells was significantly inhibited by ventilagolin, and the growth inhibitory rate increased with increasing concentration. IC50of ventilagolin was 124.77μmol·L-1after 24 hours. A characteristic apoptosis change including nuclear disintergration and chromatin agglomerate was displayed. The apoptosis rate of HepG2 cell treated with 60, 90 μmol·L-1ventilagolin was significantly higher than that of the control group, and the percentage of G2/M phase of HepG2 cell was also significantly higher than that of the control group. F-actin cytoskeletal protein was showed from polymerization to depolymerization after ventilagolin treatment. Conclusion: Ventilagolin can obviously inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells. The mechanisms may be due to blocking cell cycle and depolymerizating cytoskeletal protein F-actin.

Ventilagolin; HepG2 cell; Antiproliferation; Apoptosis; Cytoskeletal protein

广西自然科学基金系项目(2016GXNSFAA380092)-瑶药紫九牛中翼核果素衍生物的合成及抗肿瘤活性研究；广西中药质量标准研究重点实验室研究课题(桂中重自201601)-瑶药紫九牛中翼核果醌-I的初步结构修饰与活性研究；广西中药质量标准研究重点实验室青年骨干创新基金(桂中重自201506)-瑶药翼核果化学成分及活性的系统性研究

刘 瑛(1982-)，女，湖北汉川人，助理研究员，医学硕士，从事天然药物分子药理学的临床与研究。

△通讯作者：陆国寿，男，副主任药师，从事中药化学的临床与研究，Tel：0771-5868986, E-mail:luguoshou@foxmai.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)06-0791-04

2016-12-11