冠脉通片补肾活血法对大鼠肾阳虚心梗模型的拆方研究❋

苗淑杰，王 蕾，吕 楠，杜雪梅，郝 迪，李 旭，刘洪斌△

(1.天津同仁堂集团有限公司，天津 300000;2.天津市医药科学研究所，天津 300020)



【实验研究】

冠脉通片补肾活血法对大鼠肾阳虚心梗模型的拆方研究❋

苗淑杰1，王 蕾2，吕 楠2，杜雪梅1，郝 迪2，李 旭2，刘洪斌2△

(1.天津同仁堂集团有限公司，天津 300000;2.天津市医药科学研究所，天津 300020)

目的：观察冠脉通片对肾阳虚心梗大鼠心肌梗死改善作用。方法：腺嘌呤灌胃+左冠状动脉前降支结扎法制备肾阳虚心梗大鼠模型，结扎前2 d给予冠脉通片全方2.6 g生药/kg，补肾拆方、活血开窍拆方灌胃给药连续5 d，以血清肌钙蛋白T(cTn-T)、心电图ST段、小动物超声心动图射血分数(EF%)、梗死心肌NBT染色评价药效作用，以血清肌酐(Cr)、总三碘甲状腺原氨酸(T3)、总甲状腺激素(T4)作为评价肾阳虚改善指标。结果：冠脉通片全方组对ST段、EF%、梗死面积均有显著作用，可有效降低血清Cr、升高T3、T4水平，补肾与活血拆方药效作用均不及冠脉通全方组。结论：冠脉通片全方补肾、活血功效兼备，为冠脉通片治疗心梗的证候特点提供药理学数据参考。

补肾活血；冠脉通片；肾阳虚心梗；肌钙蛋白T；小动物超声心动图

冠脉通片是天津市同仁堂集团股份有限公司在冠心II号方的基础上，将枸杞子、何首乌、淫羊藿、红花、石菖蒲、丹参、桑寄生、冰片制成冠脉通片，其中枸杞子、桑寄生、何首乌能补益肝肾，淫羊藿能滋阴补阳、壮阳强身，石菖蒲与冰片能化痰开窍化湿，红花与丹参活血化瘀、行气止痛。该药用于肝肾不足、痰瘀阻络之胸痹。有报道对冠脉通片心肌缺血再灌注损伤[1]、大鼠血栓形成[2]、脑缺血再灌注模型[3]的保护作用及机制已有研究。本文以冠脉通片补肾活血功效为切入点，针对其在方药组成和功用上兼具补肾和活血作用，以大鼠肾阳虚心梗证候模型为基础，采用拆方法对冠脉通片补肾活血功效予以研究。

1 材料

1.1 试验药物

冠脉通片由天津市同仁堂集团股份有限公司提供，受试样品为压片之前的小颗粒(批号为cj06017)，规格为棕褐色小颗粒，生药量为2.9265 g生药/g，0.3 g颗粒/片。补肾拆方由同仁堂提供，规格为棕褐色小颗粒，生药量与冠脉通片全方中补肾成分含量相当；活血开窍拆方由同仁堂提供，规格为棕褐色小颗粒，生药量与冠脉通片全方中活血开窍成分含量相当。

1.2 动物

SD大鼠购于北京大学医学部实验动物科学部(许可证号SYXK(津)2011-0003)。65只雄性SD大鼠，8～9周龄成年鼠，体质量(250±10) g。

1.3 试剂

腺嘌呤C5H5N5购自上海润捷化学试剂有限公司，纯度≥98.0%(批号131101)。使用前用1.0%羧甲基纤维素钠(CMC)配制成2%腺嘌呤混悬液。

1.4 仪器

小动物人工呼吸机(Rodent ventilator DH-150，浙江大学医学仪器厂)、心电图机(Nihon Kohden Corporation Cardiofax)、小动物超声成像系统(VisualSonics Vevo 2100)。

2 方法

2.1 造模方法

采用“腺嘌呤+左冠状动脉前降支结扎法”制备肾阳虚心梗模型，即灌胃腺嘌呤200 mg/kg/d，每日1次，连续3周，造成大鼠肾阳虚，然后行冠状动脉前降支结扎法(AMI)制备大鼠急性心肌梗死模型。将大鼠经4.5%戊巴比妥钠溶液按1 ml/kg腹腔注射麻醉后，背位固定于手术台上，无菌操作下沿大鼠左腋下与胸骨剑突连线处用刀片切开皮肤，逐层钝性分离肌肉，将面罩罩住大鼠口鼻连接人工呼吸机(参数设定为呼吸比1∶3，潮气量32，呼吸频率60)，沿4、5肋间开胸分离心包膜，挤出心脏至可见动脉圆锥，永久性结扎左冠状动脉前降支，心脏复位后立即制造胸腔负压状态，缝合肌肉皮肤，从而实现肾阳虚心梗的证候模型。假手术对照组采用“灌胃纯净水+AMI仅穿线不结扎法”。

2.2 分组方法

除假手术对照组外，将肾阳虚大鼠按照血清肌酐(Cr)水平随机分为肾阳虚心梗模型对照组、冠脉通片全方组(2.6 g生药/kg，相当于临床人用剂量12倍)、补肾拆方组(生药含量相当于全方补肾成分，为临床人用剂量12倍)、活血开窍拆方组(生药含量相当于全方活血成分，为临床人用剂量12倍)。

2.3 给药方法

采用预防性给药，于AMI术前2 d灌胃相应受试药物，术前30 min给药1次，术后给药5 d，每日1次。

2.4 指标测定方法

2.4.1 对死亡率的影响 以24 h围手术期内死亡例数作为死亡率。

2.4.2 对心梗指标的影响 术后31 h各组取部分存活大鼠测定心梗指标，包括化学发光法测定结扎后31 h血浆肌钙蛋白T(cTn-T)含量，采用心电图机测定大鼠肢体II导联ST段抬高幅度，小动物超声成像系统测定麻醉大鼠心脏超声心动图。将大鼠以4.5%戊巴比妥钠麻醉，电动剃毛器剔除心区体毛，仰卧于观测台上，剃毛处均匀涂抹足量耦合剂，采用适宜探头置于心区测定。采用数据处理系统计算射血分数EF%和梗死面积质量。将心脏组织置入生理盐水中泵清血液，将心肌切成2 mm片，置于1%NBT染液中，梗死面积呈现灰白色，非梗死面积为红色。剪下梗死面积称量湿重，与全心湿重的百分比作为梗死面积质量。

2.4.3 对肾阳虚指标的影响 实验终点各组取部分大鼠测定肾阳虚指标，采用苦味酸速率法测定血清Cr，化学发光法测定血清T3、T4水平。

3 结果

3.1 冠脉通拆方对大鼠急性心肌梗死死亡率的预防作用比较

表1显示，冠状动脉结扎术后死亡时间多为结扎即刻至24 h之内。冠脉通全方和补肾拆方组能有效降低死亡率(P<0.05)，活血开窍拆方组死亡率不但未降低反而高于模型对照组。对全方和补肾、活血开窍拆方各组大鼠死亡情况比较可见，补肾作用对肾阳虚条件下的心梗发生时死亡预防作用最明显，单用活血成分对死亡预防作用不利，而全方对死亡预防的作用与补肾拆方相当。各实验组在31 h采血测定cTn-T 时存在麻醉致死情况，分别为假手术对照组1只，模型对照组4只，全方组2只，补肾组1只，活血组1只。

表1 拆方研究对肾阳虚大鼠急性心肌梗死发生时死亡预防作用

注：与模型组卡方检验：★P<0.05

3.2 冠脉通拆方对肾阳虚心梗大鼠血清肌钙蛋白T、心电图ST段抬高幅度、射血分数(EF%)、梗死重量百分比的作用比较

表2图1～3显示，与假手术对照组比较，肾阳虚心梗大鼠血清cTn-T明显升高(P<0.01)，活血开窍拆方组对cTn-T降低作用最明显，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。肾阳虚心梗大鼠心电图ST段明显抬高(P<0.01)，活血开窍拆方组与冠脉通片全方组抑制ST段抬高的作用明显，与假手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而补肾拆方组对ST段作用不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。肾阳虚心梗大鼠左心室射血分数(EF)明显减少，与假手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，冠脉通片全方组能有效增加EF(P<0.05)，而补肾拆方与活血开窍拆方组对EF作用均不明显。肾阳虚心梗大鼠心肌梗死面积达33.2%，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)，活血开窍拆方与冠脉通片全方能明显降低梗死心肌范围(P<0.05)，而补肾拆方对心肌梗死范围作用不明显。

表2 冠脉通拆方对肾阳虚心梗大鼠血清肌钙蛋白T、心电图ST段抬高幅度、EF%、梗死质量百分比作用比较±s)

注：与假手术对照组方差分析比较:★★P<0.01，与模型对照组方差分析比较:☆P<0.05

图1 冠脉通片补肾活血法对大鼠肾阳虚心梗模型心电图ST段的影响

图2 冠脉通片补肾活血法对大鼠肾阳虚心梗模型超声心动图的影响

图3 冠脉通片补肾活血法对大鼠肾阳虚心梗模型梗死心肌NBT染色面积的影响

3.3 冠脉通拆方对大鼠肾阳虚心梗血清Cr、T3、T4的作用比较

表3显示，肾阳虚心梗模型组Cr明显高于假手术对照组(P<0.01)，T3、T4明显低于假手术对照组(P<0.05)，冠脉通片全方降低Cr作用明显(P<0.05)，升高T3、T4作用显著(P<0.05)。补肾拆方组和活血开窍拆方组降低Cr、升高T3、T4的作用均不明显(P>0.05)。

表3 冠脉通拆方对大鼠肾阳虚心梗血清Cr、T3、T4的作用比较

注：与假手术对照组t检验比较：★P<0.05，★★P<0.01；与模型对照组方差分析比较：☆P<0.05，☆☆P<0.01

4 讨论与结论

本项目组对前期研究结果表明，冠脉通片对大鼠急性心肌梗死有明确的药效作用。冠脉通片临床应用已有多年，对临床心梗的治疗特色和临床定位是本项目要解决的关键问题。通过对药味组成分析，冠脉通片具有补肾和活血两方面功效，用于肝肾不足、痰瘀阻络之胸痹。胸痹心痛病机为本虚标实，本虚即为肾虚尤其是肾阳虚衰。因此，本项目我们对冠脉通片防治心梗作用的研究突出补肾活血作用特点，动物模型采用灌胃腺嘌呤+左冠状动脉前降支法制备大鼠肾阳虚型心肌梗死证候模型，评价指标包括对缺血心肌保护和对肾阳虚两方面的综合作用。我们将受试组分为冠脉通片全方组、补肾拆方组、活血开窍拆方组，旨在验证冠脉通片兼具补肾和活血两方面的作用，对肾阳虚心梗具有补肾、活血双方面的增效作用。

本实验采用灌胃腺嘌呤法制备大鼠肾阳虚证，腺嘌呤是核算的主要组成成分之一，当机体摄入大剂量腺嘌呤时，异常高浓度的腺嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下转变成极难溶解于水的2.8-二羟基腺嘌呤，这种代谢产物沉积于肾小管与肾间质部位，形成异物肉芽肿性炎症，并堵塞肾小管腔引起相应的肾小管腔呈囊状扩张。随着病程的进展，肾单位大量丧失，导致肾功能衰竭[4]。腺嘌呤代谢产物不仅因机械性阻塞肾小管而引起肾功能衰竭，而且还可能由于腺嘌呤代谢产物“毒性”作用，使肾组织中与糖、脂肪、蛋白质代谢有关的多种酶活性受到抑制，影响肾组织的能量代谢，进而出现一系列的阳虚表现，如动物竖毛拱背、畏寒怕冷、活动及觅食减少等。较之氢化可的松诱导的肾阳虚证候模型具有阳虚症状明显、肾脏组织病理改变较重，病程较长，更符合实验要求。

本实验肾阳虚指标除血清肾功能指标外，甲状腺激素也是肾阳虚评价指标之一。甲状腺素是一种缓慢而长效的调节产热的激素，与机体能量代谢密切相关，其含量降低会出现甲状腺功能减低等一系列阳虚症状。甲状腺功能的降低在肾阳虚病机学中具有重要意义，临床肾阳虚患者血清T3、T4水平明显低于健康者。文献报道，腺嘌呤诱导的肾阳虚模型T3、T4水平较氢化可的松诱导的肾阳虚模型偏低。故从反映甲状腺功能抑制的指标T3、T4来看，腺嘌呤诱导的肾阳虚模型较氢化可的松诱导的肾阳虚模型更符合要求。

对心肌梗死药效的评价从死亡率、血清cTn-T、超声心动图(射血分数)、心电图ST段变化、梗死心肌NBT染色分析。大鼠心肌梗死术是具有较高死亡率的术式，本实验室对大鼠单纯心梗手术造模死亡率控制较稳定，约在26.0%～33.%之间。本项目在肾阳虚基础上合并心梗手术，术中及术后总死亡率略升高，达36.8%。cTn-T在心肌梗死早期诊断中具有较高灵敏度和较强特异性，较LDH、CK、CK-MB升高时间更早。我们以往实验数据表明，大鼠AMI模型中，血清cTn-T高峰表达期为31 h，术后31 h目内眦取血测定cTn-T是评价心肌梗死药效的较为实用的方法[5]。小动物超声心动图具备准备、无创、安全、可重复性强的优点，是观察小动物心脏结构和功能的有利手段。本实验采用小动物超声心动图对肾阳虚心梗小鼠左心室射血功能给予测定。此外，心电图ST段改变和心肌梗死NBT染色分析均是大鼠心梗药效评价的经典指标。

在大鼠肾阳虚心梗模型的基础上，补肾拆方和冠脉通片全方对死亡的预防作用最突出，这与中医理论对肾的论述相一致。肾为五脏之本，阴阳之根，心主阳气和主血脉的功能需肾之资助，方能维持其正常的生理功能。尽管活血开窍拆方组对cTn-T降低作用最明显，但若无温补肾阳之品，其预防心梗死亡的能力则难以体现。与补肾拆方和活血开窍拆方比较，对血清Cr、T3、T4、EF、ST段、梗死面积各项指标的评价均以冠脉通片全方效果最显著。

综上所述，本实验以大鼠肾阳虚心梗证候模型为研究对象，采用拆方的方法，对补肾作用、活血开窍作用、冠脉通片补肾活血法予以比较研究。结果表明，冠脉通片全方补肾、活血功效兼备，助肾阳以维持生命之本，活血开窍以化瘀除痹。本实验通过基础研究手段，为冠脉通片治疗心梗的证候特点研究提供了药理学数据参考。

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[3] 张翠香，刘建勋，李丹，等.冠脉通片对大鼠脑缺血再灌注模型神经行为、小角质细胞活化和SOD与MDA表达的影响[J].中华中医药杂志，2015，30(2)：401-404.

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Study on the Effects of Guan Mai Tong Tablet on the Coronary Heart Yang Deficiency and Myocardial Infarction Model by Tonifying Kidney and Promoting Blood Circulation

MIAO Shu-jie1，WANG Lei2，LV Nan2，DU Xue-mei1，HAO Di2，LI Xu2，LIU Hong-bin2△

(1.TianjinTongRenTangGroupCo.,Ltd.，Tianjin300020，China;2.DepartmentofPathology，Tianjininstituteofmedicalandpharmaceuticalsciences，Tianjin300020，China)

Objective：Study of invigorating the kidney and promoting blood circulation of Guan Mai Tong Tablet on the myocardral infarction rat model of kidney Yang deficiency. Methods：Kidney Yang Deficiency of rat model were made by adenine+AMI，GMT were made by oral in 2 days before adenine+AMI. Warm kidney yang group were included by Epimedium davidii Franch.，Lycium barbarum L.，Fallopia multiflora (Thunb.) Harald，Taxillus chinensis)，Blood circulation group were included by Salvia miltiorrhiza Bunge，Flos Carthami). cTn-T，ST，EF，weight of myocardial infarction，Cr，T3，T4 were observed. Results：The rate of Infarction in warm kidney yang group and GMT group were reduced.cTn-T and weight of myocardial infarction were induced in blood circulation group. Serum Cr in GMT group were induced，T3 and T4 were increased. Conclusion：This experiment by means of basic research on coronary artery through the characteristics of TCM Syndromes of tablets in the treatment of myocardial infarction provide pharmacological data for reference. Key words: Invigorating the Kidney and Promoting Blood Circulation；GMT tablet； Myocardral Infarction Model of Kidney Yang Deficiency；cTn-T；Ultrasonic echocardiography of Animals

天津市中医药管理局中医、中西医结合专项(13180)-补肾活血法对心梗预防作用机理研究;国家自然科学基金青年基金项目(81202801)-(P)RR介导MAPK信号通路对心肾综合征联动作用及益气温阳、活血利水治则机制研究

苗淑杰(1973-)，女，吉林人，高级工程师，医学博士，从事药品的研究与开发。

△通讯作者：刘洪斌(1972-)，从事药理研究，E-mail：jtss@sina.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)06-0783-04

2016-12-16