8周爬梯负重训练诱导大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α/FNDC5/MSTN差异表达

李鹏飞房国梁杨星雅李良于涛田野

1国家体育总局体育科学研究所（北京100061）2国家体育总局反兴奋剂中心（北京100029）

8周爬梯负重训练诱导大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α/FNDC5/MSTN差异表达

李鹏飞1房国梁1杨星雅1李良1于涛1田野2

1国家体育总局体育科学研究所（北京100061）2国家体育总局反兴奋剂中心（北京100029）

目的：观察8周爬梯负重训练对SD大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α/FNDC5/MSTN表达及血清Irisin浓度的影响。方法：20只SD大鼠随机平均分为对照组（Con组，n=10）和爬梯训练组（Lad组，n=10），Lad组采用改进的爬梯负重抗阻力量训练模型，3天训练1轮，共进行8周。训练结束后48小时取比目鱼肌和趾长伸肌，用定量PCR和Western Blot法检测肌肉组织中PGC1α/FNDC5/MSTN的基因和蛋白表达，用Elisa法检测血清Irisin浓度。结果：与Con组相比，Lad组比目鱼肌PGC1α表达显著降低（P＜0.05）、FNDC5表达有降低趋势，MSTN表达显著增加（P＜0.05）；而趾长伸肌PGC1α表达显著增加（P＜0.05）、FNDC5表达有增加趋势，MSTN表达显著降低（P＜0.05）；血清Irisin浓度无明显差异（P＞0.05）。结论：8周爬梯负重训练诱导SD大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α/FNDC5/MSTN差异表达但不影响血清Irisin浓度，提示长期抗阻力量训练后机体可能存在复杂的平衡拮抗机制。

爬梯负重训练；骨骼肌；PGC1α；FNDC5；Irisin；MSTN

骨骼肌不仅是机体能量代谢平衡的“运动员”，还是“教练员”——分泌多种因子正向或负向调节其它组织器官的能量代谢，例如肌肉抑制素（Myostatin，MSTN）就是骨骼肌的一种负向调节机制，在局部发挥抑制肌肉组织生长和能量代谢的调节作用[1]。近些年阐明的一种骨骼肌正向调节机制——过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子α（PGC1α）-III型纤连蛋白结构域5（FNDC5）-鸢尾素（Irisin）也引起了研究人员的高度关注，有研究表明，耐力运动方式或跑台训练模型诱导骨骼肌PGC1α-FNDC5高表达后分泌Irisin入血，而活性物质Irisin具有促进物质和能量代谢的积极作用[2]。

力量训练同耐力运动一样具有促进机体能量代谢的积极效应，但力量训练对于PGC1α-FNDC5-Irisin机制是否也同样有效，目前还没有相关研究报道。因此，本研究通过大鼠力量训练模型即8周爬梯负重训练，观察这种运动方式对骨骼肌（比目鱼肌和趾长伸肌）PGC1α-FNDC5-Irisin机制的效应和作用，并选择MSTN因子作为对照机制，比较这种训练对比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α/FNDC5/MSTN表达及血清Irisin激素分泌水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象与分组

动物实验通过动物福利及实验伦理审查。20只SPF级SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2012-0001］，雄性，6周龄。在动物实验室分笼饲养，自由进食和饮水，室温18～24℃，湿度40%～60%，12 hr/12 hr光照。

适应环境1周后，随机平均分为安静对照组（Con组）和爬梯负重训练组（Lad组），每组10只，称量训练前体质量。Lad组再适应爬梯1周。训练取材后Con组的比目鱼肌（SOL Muscle）和趾长伸肌（EDL Muscle）分别记作Con-S和Con-E，Lad组的比目鱼肌和趾长伸肌分别记作Lad-S和Lad-E。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 爬梯负重训练模型

对Lee[3]爬梯负重训练模型进行技术改进，见图1（实用新型专利ZL 2016 2 0203540.4）：长1.1 m×宽 0.18 m，80°角倾斜稳固放置，两侧有安全护板，防滑台阶间隔2 cm，顶部笼型平台方便于运动间歇休息，负重砝码固定于大鼠尾部。

1.2.2 仪器与试剂

美国Bio-Rad公司CFX96实时荧光定量PCR仪；美国Cavoy公司Mini P-4电泳槽、湿转电泳槽；美国Thermo公司Multiscan酶标仪。

北京BioTeke公司2×SYBR Real-time PCR pre⁃mixture（PR7002）定量试剂盒；美国Abcam公司Anti-PGC1 alpha antibody（ab54481）、Anti-FNDC5 antibody（ab174833）、Anti-MSTN antibody（ab203076）；美国Phoenix公司Irisin Recombinant Enzyme-linked Immu⁃nosorbent Assay（EK-067-29）。

1.3 训练方案和取材

1.3.1 爬梯负重训练方案

安静对照组不训练。爬梯负重训练方案参考Safa⁃rzade等[4]的研究，具体为：

（1）无负重适应训练：要求在没有刺激下自愿爬梯3次，间隔2 min。大鼠适应爬梯后3天开始负重训练；

（2）正式负重训练：初始负重为大鼠体质量的75%，然后每次递增负重30 g，直到大鼠完成8次训练或已无法完成整个爬梯高度，大鼠能够成功完成爬梯高度的最大负重是该轮最大负重。下一轮前4次爬梯，负重分别为上轮最大负重的50%、75%、90%和100%，后4次爬梯每次递增负重30 g，直到大鼠完成8次训练或已无法完成整个爬梯高度，以确定新的最大负重。以此类推，每3天训练一轮，共8周18轮。

1.3.2 取材

整个训练结束后的48小时[5，6]取材，麻醉处死动物，称量训练后体质量。腹主动脉取血。分离右侧比目鱼肌和趾长伸肌，预冷PBS缓冲液冲洗表面血液，称重。锡箔纸包裹、标记后－80℃液氮保存用于检测。

1.4 指标检测

1.4.1 RT T--P P C C R R法检测P P G G C C11α、F F N N D D C C55和M M S S T T N N基因表达

离心柱型高纯RNA快速提取法提取总RNA：研碎肌肉，每100 mg组织加1 ml裂解液剧烈震荡混匀，加0.2 ml氯仿剧烈振荡15 sec，12000 rpm、4℃离心10 min，转移水相加入1倍70%乙醇颠倒混匀转入吸附柱中，10000 rpm离心45 sec弃废液，加500μL去蛋白液12000 rpm离心45 sec，加700μL漂洗液12000 rpm离心1 min×2次，将吸附柱放回空收集管，12000 rpm离心2 min去漂洗液，吸附柱放入离心管中加80μL无RNA酶水，12000 rpm离心1 min得到洗脱溶液。紫外分光光度法测定RNA浓度。

逆转录20μL反应体系包括：模板RNA 2μg，Oligo dT 1μL，5×Reaction Buffer 4μL，RNase Inhib⁃itor 0.5μL，dNTP Mix 2μL，M-MLV RT 1μL，无RNA酶DEPC水定容至20μL。42℃60 min，70℃10 min。反应后取出置冰上进行后续实验。

SYBR Green染料法定量扩增，20μL反应体系包括：模板1μL，2×Premix 10μL，上、下游引物各0.4 μL，无菌水8.2μL。反应条件95℃预变性2 min，95℃15 sec，60～62℃15 sec，70℃15 sec，45个循环。统计CT值。靶基因引物序列由上海生工合成，见表1。

表1 靶基因引物序列表

1.4.2 Western n B B l l o o t t法检测P P G G C C11α、F F N N D D C C55和M M S S T T N N蛋白表达

预冷RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂，按1︰9比例加入裂解液冰上匀浆，13000 rpm、4℃离心20 min，取上清。BCA（Bicinchoninic acid）法测蛋白浓度，BSA（Bovine Serum Albumin）为标准品。12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，每孔上样量20μg，湿转法转膜1 hr，3% BSA-TBST（Tris-Buffered Saline and Tween 20）封闭30min，一抗（PGC1α1︰2000，FNDC5 1︰4000，MSTN 1︰2000，GAPDH 1︰20000）4℃孵育过夜，TBST洗膜5次×3min，加入二抗（山羊抗兔IgG HRP 1︰10000）室温轻摇40 min，洗膜6次×3 min，增强化学发光ECL（Enhanced chemiluminescence）显色。计算目的蛋白与内参灰度比值。

1.4.3 E E l l i i s s a a法检测血清Ir r i i s s i i n n浓度

Phoenix重组Irisin酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠血清Irisin，用酶标仪在450 nm单波长读取O.D.值。4参数对数拟合曲线法建立标准品的反S曲线，并计算样品浓度。

1.5 统计学方法

所有数据结果以均数±标准差表示，用Excel和SPSS统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 88周爬梯负重训练对S S D D大鼠体质量和比目鱼肌//趾长伸肌湿重的影响

表2显示，训练前，实验组大鼠体质量与安静对照组相比没有差异。但经过8周爬梯负重训练后，实验组大鼠体质量与安静对照组相比显著降低（P＜0.05），表明8周抗阻力量训练对大鼠体质量有明显效应。

实验组趾长伸肌湿重与对照组相比显著降低（P＜0.05），其他湿重指标实验组比对照组有降低趋势但无显著性差异，表明8周抗阻力量训练对大鼠比目鱼肌/趾长伸肌湿重有降低效应。

表2 各组大鼠体质量和比目鱼肌/趾长伸肌湿重比较

2.2 88周爬梯负重训练对大鼠比目鱼肌和趾长伸肌P P G G C C11α//F F N N D D C C55//M M S S T T N N基因表达的影响

图2显示，经过8周爬梯负重训练后，实验组大鼠比目鱼肌PGC1α基因表达比对照组显著降低（P＜0.05）；但实验组趾长伸肌PGC1α基因表达却比对照组显著增加（P＜0.05）。

图2 各组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α基因表达比较（各组均n=10）

图3显示，经过8周爬梯负重训练后，实验组大鼠比目鱼肌FNDC5基因表达与对照组相比有降低趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；而实验组趾长伸肌FNDC5基因表达与对照组相比有增加趋势但也无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌FNDC5基因表达比较（各组均n=10）

图4显示，经过8周爬梯负重训练后，实验组大鼠比目鱼肌MSTN基因表达比对照组显著增加（P＜0.05）；但实验组趾长伸肌MSTN基因表达却比对照组显著降低（P＜0.05）。

图4 各组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌MSTN基因表达比较（各组均n=10）

2.3 88周爬梯负重训练对大鼠比目鱼肌和趾长伸肌P P G G C C11α//F F N N D D C C55//M M S S T T N N蛋白表达的影响

图5显示，经过8周爬梯负重训练后，训练组大鼠比目鱼肌PGC1α蛋白表达比对照组显著降低（P＜0.05）；但训练组趾长伸肌PGC1α蛋白表达却比对照组显著增加（P＜0.05）。

图5 各组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α蛋白表达比较（各组均n=10）

图6显示，经过8周爬梯负重训练后，训练组大鼠比目鱼肌FNDC5蛋白表达与对照组相比有降低趋势但无显著差异（P＞0.05）；而实验组趾长伸肌FNDC5蛋白表达比对照组有明显增加（P＜0.05），这一点不太同于图3结果提示蛋白水平与基因水平可能在表达时间上不完全一致，但差异趋势还是趋同的。

图6 各组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌FNDC5蛋白表达比较（各组均n=10）

图7显示，经过8周爬梯负重训练后，训练组大鼠比目鱼肌MSTN蛋白表达比对照组显著增加（P＜0.05）；但训练组趾长伸肌MSTN蛋白表达却比对照组显著降低（P＜0.05）。

图7 各组大鼠比目鱼肌和趾长伸肌MSTN蛋白表达比较（各组均n=10）

2.4 88周爬梯负重训练对S S D D大鼠血清Ir r i i s s i i n n浓度的影响

图8显示，与安静对照组相比，实验组大鼠血清Iri⁃sin浓度无显著变化（P＞0.05）。

图8 各组大鼠血清Irisin浓度比较（各组n=10）

3 讨论

PGC1α作为一种辅助转录激活因子可促进糖脂转运与分解代谢，还调节下游不同靶转录因子和调控单元[7，8]；FNDC5即III型纤连蛋白结构域5，这种跨膜蛋白以中间疏水结构域嵌入细胞膜，以连接膜内的C末端结构域和膜外的蛋白结构域及N末端信号肽；Irisin即鸢尾素，它是由FNDC5被水解掉的膜外结构转变并被命名的一种新形式。这个机制主要过程为：运动首先诱导骨骼肌高表达PGC1α，PGC1α进而促进下游分子FNDC5裂解，随后FNDC5膜外结构转变为Irisin并分泌入血，而Irisin激素具有促进白色脂肪棕色化、加快能量代谢，从而减轻体重以及调节葡萄糖稳态的作用。多项后续支持性研究表明，有氧耐力运动或长期游泳及跑台训练方式能诱发这样的正向机制[9，10]。

另一方面，作为一个新的明星分子，不同研究中对Irisin的评价也不同[11，12]。尽管如此，人们还是有理由相信骨骼肌PGC1α-FNDC5-Irisin机制在运动锻炼和能量再平衡调节之间又建立了一个新的分子联系。周伟等[13-16]近期的几篇综述从不同视角对国外多项相关研究（鼠、人）进行比较、汇总和详细列表后认为：虽然在已有的研究中发现不同运动强度、时间、年龄、肌肉类型和锻炼方式对机体Irisin表达及分泌的规律的影响存在较大差异甚至有些矛盾，而且导致这样结果的可能原因（包括实验设计因素[17]）也十分复杂，但不能否认这个机制至少在当下看来仍具有相当的积极影响和意义。

由于到目前为止，还未见有力量训练模型是否也能同样诱发这个PGC1α-FNDC5-Irisin机制的研究报道，故本研究以改进的负重训练爬梯构建大鼠抗阻力量模型，3天训练1轮，共进行了8周，初始负重为大鼠体质量的75%，最后一轮最大负重为大鼠体质量的1.64倍（Farina等[18]曾报道“第8周负荷为其体质量的120%”，具体训练负重变化及引起的骨骼肌形态改变另文介绍），以大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α/FNDC5/MSTN表达和血清Irisin浓度为观察指标，结果表明，SD大鼠经过8周爬梯负重训练后，与对照组相比，训练组比目鱼肌PGC1α表达显著降低（P＜0.05）、FNDC5表达有降低趋势，MSTN表达显著增加（P＜0.05）；而趾长伸肌PGC1α表达显著增加（P＜0.05）、FNDC5表达有增加趋势，MSTN表达显著降低（P＜0.05）；血清Irisin浓度无明显差异。

研究表明MSTN因子可能作为一种促进因素参与了代谢综合症的发生，被认为是骨骼肌生长的负调控因子，和上述PGC1α-FNDC5-Irisin作用机制相反。因此在本研究中选择MSTN因子作为PGC1α-FNDC5-Iri⁃sin机制的反向参照。本研究中大鼠爬梯负重训练对MSTN因子的效应结果与其它研究报道可以进行相互印证及阐释[19]。

本研究中大鼠爬梯负重训练对PGC1α-FNDC5-Irisin机制的复杂作用首先表明长期抗阻力量训练确实显著影响了骨骼肌局部的活性因子表达和作用，并表现出与有氧耐力训练不尽相同的机制和特点。其次，这种训练对比目鱼肌和趾长伸肌产生的不同作用可能与快、慢肌纤维构成有关。比目鱼肌中的慢肌纤维成份占80%以上，主要与长时间缓慢运动相关；而趾长伸肌是典型的快肌，90%以上为快肌纤维成份，可以在短时间内产生较大的力量。有研究报道，氧化酶系统、肌红蛋白等在慢肌中含量很高，而快肌纤维中三磷酸腺苷酶以及与糖酵解途径相关的酶呈高表达[20]。因此，肌纤维类型的多样性及酶蛋白表达的复杂性决定了两种肌组织对长期抗阻力量训练的不同效应，即可能不断反复及强烈刺激趾长伸肌功能的同时却长期抑制了比目鱼肌功能，由此引起了PGC1α/FNDC5活性因子（包括MSTN因子）在两种肌纤维中截然相反的表达。当然更深入的机制还需要进一步研究探讨。第三，由于血清Irisin在来源上是由FNDC5被酶解后的片段分泌入血的，所以本研究中抗阻力量训练后血清Irisin浓度变化的不显著可能与两个因素有关：首先似乎可能与前述结果中提到的运动后不同骨骼肌组织PGC1α/ FNDC5表达的相互拮抗抵消有关，其次可能是与FNDC5已经减弱的差异表达有关，即在PGC1α-FNDC5-Irisin机制上，存在从PGC1α显著效应到FNDC5不显著趋势再到Irisin没有明显变化这样一个递减的信号效应。最后，如果我们进一步辩证地看待这种骨骼肌局部PGC1α/FNDC5表达差异而血清Irisin浓度却不显著的现象，似乎可以在一定程度上对长期以来针对Irisin的各种质疑进行回应，即不能因整体效应的不“理想”而轻视或否定局部变化的客观性。因此继续深入探讨运动方式对PGC1α-FNDC5-Irisin因子的影响机制和作用非常重要。

4 结论

8周爬梯负重训练诱导SD大鼠比目鱼肌和趾长伸肌PGC1α/FNDC5/MSTN差异表达但不影响血清Irisin浓度，提示长期抗阻力量训练后机体可能存在复杂的平衡拮抗机制。

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Eight-week Climbing Ladder Exercisew ith Load InducesDifferential Expression of PGC1α/FNDC5/ MSTN in Soleusand Extensor Digitorum LongusM uscle in SD Rats

LiPengfei1，Fang Guoliang1，Yang Xingya1，Li Liang1，Yu Tao1，Tian Ye2
1China InstituteofSportScience，Beijing 100061，China 2China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China Corresponding Author：LiPengfei，Email：lipengfei@ciss.cn

ObjectiveTo observe the effect of 8-week climbing ladder exercise with load on the ex⁃pression of proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha（PGC1α）/fibronectin typeⅢdo⁃main containing 5（FNDC5）/myostatin（MSTN）in soleus and extensor digitorum longus muscle and the serum concentration of irisin in Sprague-Dawley（SD）rats.M ethodsTwenty SD rats were random⁃ly divided into a control（Con，n=10）group and a climbing ladder（Lad，n=10）group.The Lad group took an 8-week and once-every-3-day program of resistance exercise using an improved model of climbing ladder with load.Then the soleus and extensor digitorum longus muscles were isolated at 48 h after exercise.The PGC1α/FNDC5/MSTN mRNA and protein expression in the skeleton muscle were de⁃tected using quantitative PCR and Western blotting respectively.The serum concentration of irisin was measured using enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsCompared with Con group，the expression of PGC1αin the soleus muscle reduced significantly（P＜0.05），that of FNDC5 reduced but without sig⁃nificance and that of MSTN increased significantly（P＜0.05）in Lad group.However，the expression of PGC1αin the extensor digitorum longus muscle increased significantly（P＜0.05），that of FNDC5 in⁃creased but without significance and that of MSTN decreased significantly（P＜0.05）in Lad group com⁃pared with Con group.There were no significant differences in the serum concentration of irisin be⁃tween the two groups.Conclusion Eight-week climbing ladder exercise with load on rats induces dif⁃ferential expression of PGC1α/FNDC5/MSTN in soleus and extensor digitorum longus muscle，but doesn’t influence the serum concentration of irisin.It is suggested that there may be a complex mechanism of balancing and antagonism in the body after long-term resistance exercises.

climbing ladder exercise with load，skeleton muscle，PGC1α，FNDC5，Irisin，MSTN

2016.07.27

国家体育总局体育科学研究所基本科研业务费资助项目（基本15-14）

李鹏飞，Email：lipengfei@ciss.cn