参附注射液对大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究*

沈琪琦 乔建瓯

（上海交通大学附属第九人民医院，上海200011）

·研究报告·

参附注射液对大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究*

沈琪琦 乔建瓯△

（上海交通大学附属第九人民医院，上海200011）

目的观察参附注射液对脂多糖性急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织的保护作用及探讨其可能的作用机制。方法54只健康雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为对照组（NS组）、急性肺损伤组（ALI组）、参附注射液干预组（SF组），急性肺损伤模型通过股静脉注射脂多糖（5 mg/kg）建立。SF组于造模前30 min给予参附注射液（10 mL/kg），NS组和ALI组均给予等量0.9％氯化钠注射液。分别于用药3 h、6 h、12 h后，观察大鼠肺组织的病理改变，检测血气分析，记录肺组织湿/干重比（W/D），测定大鼠肺组织中肿瘤坏死因子F-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的表达。结果与ALI组相比，SF组ALI的程度明显减轻，PaO2显著改善（P＜0.05），肺W/D比值降低（P＜0.05），肺组织TNF-α、IL-6浓度显著下降，IL-10浓度明显升高（P＜0.05）。结论参附注射液对ALI大鼠肺组织具有一定的保护作用，其机制可能是降低了TNF-α、IL-6的浓度，促进IL-10的表达，调节促炎-抗炎平衡，减轻肺部及全身的炎症反应。

急性肺损伤参附注射液TNF-αIL-6IL-10急症

急性肺损伤（ALI）是临床危重症，发病急、变化快，其死亡率非常高。ALI的病理特点是肺组织水肿、中性粒细胞浸润以及炎症反应失衡［1］。调控促炎与抗炎因子之间的平衡是有效控制炎症介质瀑布式反应的关键。近年来许多研究均提示中医药在防治ALI方面有较好的疗效，尤其是参附注射液因其“多靶效应”而广泛应用于临床。但其对脂多糖（LPS）引起的ALI的影响尚未报道。笔者通过动物实验观察参附注射液对LPS性ALI大鼠肺组织的保护作用，并探讨其可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级健康雄性Wistar大鼠54只，体质量250～300 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，生产许可证SCXK（沪）X2008-0016。

1.2 药物LPS：E.coli，美国Sigma公司，L3129。参附注射液：10 mL/支，雅安三九制药有限公司，国药准字Z51020664。

1.3 仪器与试剂血气分析仪（GEM Premier 3000），显微镜（Nikon Eclipse E600），数码显微镜照相分析软件（Image Pro Plus），石蜡切片机（4062型，德国SLEE），电子天平（ER-182 A型，日本AND公司），离心机（ZK380型，德国HERMLE）。大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、ELISA检测试剂盒（R&D，美国，上海玉博公司分装）。

1.4 造模与分组54只Wistar大鼠于实验前禁食12 h，自由饮水。ALI动物模型通过股静脉注射LPS 5 mg/kg来制备。按随机数字表法将大鼠分为3组，每组18只：0.9％氯化钠注射液对照组（NS组）、急性肺损伤组（ALI组）、参附注射液干预组（SF组）。SF组在注射LPS前30 min通过静脉给药参附注射液10 mL/kg干预，另两组给予等量NS。按3 h、6 h、12 h 3个时间点（n=6）观察实验结果。

1.5 标本采集与检测1）血气分析：腹主动脉取血0.5 mL，用于测定血气分析。2）肺湿/干重比（W/D）：分别在各个时间点处死大鼠，取左右两肺。取左下肺称重为肺脏湿重，而后置于70℃恒温烤箱中干燥72 h后称重为肺脏干重，计算W/D。3）肺组织病理检测：取左中肺组织，石蜡包埋，苏木素-伊红染色，观察肺组织病理变化和炎症浸润。4）肺组织TNF-α、IL-6及IL-10含量测定：取右肺组织300 mg制成肺组织均浆，3000 r/min离心15 min，收集上清液，ELISA方法测定TNF-α、IL-6及IL-10含量。

1.6 统计学处理应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组均数采用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA），组间两两比较采用SNK法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠PaO2及肺组织W/D比较见表1。结果显示，ALI组大鼠3个时间点PaO2较NS组均显著降低（P＜0.05），而SF组PaO2各时间点较ALI组有明显上升；ALI组大鼠W/D值随时间点的延长明显增高（P＜0.05），而各时间点SF组肺组织W/D值明显低于ALI组（P＜0.05）。

2.2 各组肺组织病理比较见图1。结果显示，与NS组比较，ALI组肺泡间隔明显增宽，部分肺泡间隔断裂，肺泡腔内有大量渗出，肺泡壁毛细血管充血明显，肺间质内可见明显炎症细胞浸润。SF组肺泡及肺部炎症情况相对于ALI组明显改善。

2.3 各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-10水平比较见表2。结果显示，NS组大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平在不同时间点差异无统计学意义（P＞0.05）。ALI组TNF-α、IL-6水平3 h开始升高，12 h达到高峰（P＜0.05）；IL-10上升缓慢，12 h达到峰值。与ALI组比较，SF组在相应时间点TNF-α和IL-6水平明显降低，IL-10水平明显升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠PaO2及肺组织W/D比较（±s）

表1 各组大鼠PaO2及肺组织W/D比较（±s）

与NS组相应时点比较，*P＜0.05；与ALI组相应时点比较，△P＜0.05。下同。

组别时间PaO2（mmHg）肺W/D NS组3 h96.16±2.784.44±0.27（n＝6）6 h94.66±3.324.71±0.44 12 h95.66±2.164.58±0.24 ALI组3 h73.83±3.81*5.93±0.50*（n＝6）6 h63.33±4.08*6.92±0.41*12 h56.50±3.61*7.76±0.68*SF组3 h82.0±4.19*△4.67±0.61△（n＝6）6 h73.50±3.83*△5.87±0.33△12 h70.16±3.18*△6.43±0.47△

图1 各组大鼠12 h肺组织HE染色（200倍）

表2 各组大鼠不同时间点肺组织TNF-α、IL-6、IL-10含量比较（ng/mg，±s）

表2 各组大鼠不同时间点肺组织TNF-α、IL-6、IL-10含量比较（ng/mg，±s）

组别时间TNF-α NS组3 h17.16±4.26（n＝6）6 h18.33±5.35 12 h16.66±4.76 ALI组3 h32.83±5.23*（n＝6）6 h37.16±4.44*12 h54.50±4.67*SF组3 h21.50±2.88△（n＝6）6 h29.16±1.47*△12 h40.66±4.50*△IL-6IL-10 20.83±2.4826.66±4.84 20.66±3.1426.16±5.41 22.00±3.0327.16±5.70 48.66±5.42*36.83±3.76*68.66±4.50*44.66±2.58*89.66±6.68*69.66±3.14*31.66±3.01*△54.66±4.88*△42.16±2.78*△82.83±5.70*△71.33±2.80*△104.0±6.72*△

3 讨论

参附注射液组方来源于参附汤，主要成分为红参、黑附片提取物，含有人参皂苷、人参多糖、乌头碱等多种活性成分，具有回阳救逆、益气固脱之功效，可使正气得以匡扶、阳气得以畅达、气血流畅运行、阴阳恢复平衡，与西药配合使用具有减毒增效作用，因此临床上广泛应用于危重病患者的抢救［2-4］。中医学认为热、瘀、水（湿）、虚是ALI的关键病机，治疗当从清热解毒、通里攻下、活血化瘀及益气扶正等方面着手［5］。研究还显示参附注射液能抑制感染性休克大鼠机体组织NF-κB的活化及炎症因子的过度释放、使促炎因子和抗炎因子达到平衡，防止过度炎性反应［6-9］。研究发现，参附注射液治疗重度脓毒血症有较好疗效［10］，而且能增加脓毒症休克患者的组织灌注，改善微循环［11］。林雪梅发现应用乌司他丁联合参附注射液治疗ARDS患者可调节患者的免疫功能、减轻炎症反应程度［12］。在大鼠肠缺血再灌注的ALI模型中，刘志刚等发现，参附注射液对其有保护作用［13］。徐鹏发现，参附注射液干预能够减轻脓毒症大鼠肺水肿、肺出血及肺不张程度，减少肺组织炎性浸润，并且使肺泡间隔逐渐修复［14］。但在LPS性ALI的模型中研究较少。其具体机制尚未完全阐明。

在全身炎症反应综合征的众多炎症介质中，TNF-α是首要因子，具有广泛生物学活性，促使多形核白细胞（PMN）在肺内聚集、黏附，释放多种促炎细胞因子，损伤肺毛细血管内皮细胞膜［15］。IL-6是机体另一个重要的促炎因子，能够启动、催化和放大炎症反应，是机体炎症与疾病严重程度的重要指标［16-17］。有研究发现，缺血再灌注肾损伤模型小鼠肺组织IL-6及TNF-α的表达与肺损伤程度密切相关，提示IL-6及TNF-α是ALI的增恶因子［18］。有学者发现，在LPS诱导的ALI模型中，大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平显著升高，提示脓毒症大鼠肺损伤时细胞因子IL-1、IL-6过度表达可能是造成脓毒症肺损伤的重要原因［19-20］。IL-10是人体内重要的抗炎因子，多项研究提示，IL-10可通过抑制单核细胞和巨噬细胞中IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子的释放，减轻ALI/ARDS动物模型肺组织损伤［21］。

本实验结果显示，参附注射液干预后，大鼠肺损伤程度明显减轻，在各个时间点较LPS组PaO2升高，W/ D值明显下降，说明SF对LPS诱导的ALI大鼠有保护作用；ALI组大鼠各时间点肺组织TNF-α、IL-6含量显著高于NS组，相比于ALI组大鼠，SF组大鼠肺组织TNF-α、IL-6含量则显著降低；ALI组大鼠3个时间点肺组织IL-10含量显著低于NS组的表达，相比于ALI组大鼠，SF组大鼠肺组织IL-10含量则显著升高。本结果提示参附注射液可通过降低促炎因子TNF-α、IL-6水平，增强抗炎因子IL-10表达，调节体内炎症介质/抗炎介质的平衡，抑制ALI的发展。

综上所述，参附注射液对LPS性ALI大鼠有一定保护作用。其机制可能是通过降低促炎因子TNF-α、IL-6水平，增强抗炎因子IL-10表达，重建炎症网络的平衡，来减轻机体过度反应的损伤。

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Protective Effects of Shenfu Injection on Acute Lung Injury in Rats

SHEN Qiqi，QIAO Jianou.The NinthPeople’s Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200011，China.

Objective：To study Protective effect of Shenfu Injection on lung tissue in rats with lipopolysaccharide induced acute lung injury and its possible mechanism.Methods：54 male Wister rats were randomly divided into the control group（NS group），acute lung injury group（ALI group），and Shenfu injection group（SF group）.A-cute lung injury model was established by injection of lipopolysaccharide（5 mg/kg）.30 min before modeling，SF group was given Shenfu injection（10 mL/kg），and NS group and ALI group were given equivalent saline.In 3 h，6 h and 12 h，the pathological changes of lung tissue in rats were observed，and blood gas analysis，Wet/dry weight ratio of lung tissue（W/D），and the expression of TNF-α，IL-6 and IL-10 in rat lung tissue were determined.Results：Compared with ALI group，the degree of acute lung injury was significantly reduced in SF group；PaO2was significantly improved（P＜0.05），and the pulmonary W/D ratio was decreased（P＜0.05）；TNF-α and IL-6 concentrations in lung tissue were significantly decreased and IL-10 concentration was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：Shenfu injection has protective effects on lung tissue of rats with ALI，whose mechanisms may involve decreasing the expression of TNF-α and IL-6，increasing the expression of IL-10，regulating the balance of pro-inflammatory and anti-inflammatory，and reduce inflammation in the lungs and the whole body.

Acute lung injury；Shenfu injection；TNF-α；IL-6；IL-10；Emergency

R285.5

A

1004-745X（2017）06-0944-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.002

2016-11-15）

国家自然科学基金项目（81170028）

△通信作者（电子邮箱：gjou@163.com）