夹脊电针联合甲基强的松龙（MP）对ASCI大鼠脊髓组织病理形态学影响的时效关系实验研究*

李晓宁单筱淳吴磊刘双岭梅继林李诺

（1.黑龙江中医药大学第二附属医院，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

·研究报告·

夹脊电针联合甲基强的松龙（MP）对ASCI大鼠脊髓组织病理形态学影响的时效关系实验研究*

李晓宁1单筱淳2吴磊2刘双岭1梅继林2李诺2

（1.黑龙江中医药大学第二附属医院，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

目的探寻夹脊电针联合甲基强的松龙（MP）治疗对大鼠急性脊髓损伤（ASCI）后组织的病理学改变影响的时效关系。方法将72只大鼠雌性Wistar大鼠按随机数字表法平均分为Sham组、ASCI组、EA+MP组，每组又分为1 d、3 d、7 d、14 d 4个亚组。采用BBB评分观察不同治疗方法在不同时间点对ASCI大鼠肢体运动功能的影响；采用HE染色观察在各个时间点对ASCI大鼠脊髓组织病理学影响；比较Sham组、ASCI组、EA+MP组在不同的时间点治疗效果，筛选最佳治疗方案。结果BBB评分结果显示，术后3 d、7 d、14 d，与ASCI组比较，EA+MP组大鼠肢体运动功能评分升高（P＜0.05），EA+MP组组间比较，14 d组明显优于3 d组；HE染色结果显示ASCI组大鼠1 d时出血明显，可见大量凋亡神经细胞；3 d时细胞破坏最明显，7 d时神经细胞凋亡有所减轻，神经细胞坏死，4 d时凋亡已不明显，可见空泡存在，治疗组神经细胞损伤情况较ASCI组明显减轻，神经细胞保存较完好。结论夹脊电针联合MP能改善ASCI大鼠运动功能评分，同时减少细胞凋亡，减轻脊髓病理学形态改变，并随着时间延长效果愈加明显。

急性脊髓损伤大鼠夹脊电针甲基强的松龙时效关系急症

脊髓损伤（SCI）致残率高，给社会和家庭造成沉重的经济负担。目前临床治疗方法［1］主要应用药物治疗如糖皮质激素治疗、Ca2+通道阻滞剂、谷氨酸受体拮抗治疗，其中甲基强的松龙（MP）因其可以显著提高节段性的脊髓神经功能恢复，在临床广泛应用。但有研究报道，MP治疗可能导致严重的并发症，比如重症感染从而加重SCI卧床患者的病情。因此，该药物治疗方案目前临床仍有待改善。夹脊电针是应用针刺夹脊穴并通以脉冲电流以治疗SCI患者的一种临床常用治疗方法。现代研究发现［2］，夹脊电针可以保护受损的神经组织细胞，改善细胞再生的微环境，但对于该治疗方案中夹脊电针治疗运用的时间目前仍未统一。因此，本研究通过建立急性脊髓损伤（ASCI）大鼠，观察夹脊电针联合MP不同治疗时间对其运动功能和脊髓组织病理形态学改变的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物健康Wistar雌性大鼠（由辽宁长生生物技术有限公司提供），保持实验动物水与粮食充足，所有大鼠需要在实验室常规饲养适应1周。

1.2 仪器及试剂水平摇床（型号WD-9405B），电泳仪（型号DYY-7C），电泳仪（型号DYY-7C），全蛋白提取试剂盒（生产公司Wanleibio，货号WLA019），BCA蛋白浓度测定试剂盒（生产公司Wanleibio，货号WLA004）。

1.3 分组及造模将72只大鼠依据随机数字表法分为3组，分别为假手术组（Sham组，24只）、急性脊髓损伤组（ASCI组，24只）、急性脊髓损伤+电针治疗+甲基强的松龙组（EA+MP组，24只）、每组又分别分为1 d、3 d、7 d及14 d 4个亚组，每组6只。采用美国Impactor Model-Ⅲspinal cord contusion system打击器，制作大鼠ASCI模型（T10，中度损伤）。腹腔麻醉后皮肤常规消毒，在T10上1.5 cm下1.5 cm切长约3 cm的纵行切口，暴露T9～11棘突，以T10为中心段脊髓，造成该段的急性脊髓中度损伤，清创后伤口部位常规分层缝合。待大鼠清醒后，分别进行BBB评分，选择BBB评分在1～3分入组，造模后大鼠单笼饲养。1分：1或2个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节。2分：1关节广泛活动或1个关节广泛活动且有另一关节轻微活动。3分：2个关节广泛活动。

1.4 实验干预方法1）Sham组。手术后常规饲养，不予任何处置。2）ASCI组。模型制备成功后单笼饲养，不予任何处置。3）EA+MP组。（1）EA：于模型制备成功后3 h进行夹脊电针早期干预治疗，此后每日1次，直至疗程结束。针刺穴位选取T9、T11节段夹脊穴。将0.35 mm×13 mm毫针直刺入所选穴位下4～5 mm，给予电针仪脉冲连续波，脉冲宽度：（0.5±0.15）ms，频率为100 Hz，脉冲峰值为Vp1≥（40±10）V（在500 Ω负载下），刺激时长为每次30 min。（2）MP：术后30 min时，给予实验大鼠一次性注射MP。MP按30 mg/kg，与0.9％氯化钠注射液配置注射液，给予大鼠腹腔注射0.5 mL；正常捆绑，其余不予任何处置。

1.5 样本采集大鼠在治疗时间点结束后，依据相对应的打击损伤时间进行麻醉，然后断头处死。于冰盒上快速取出损伤处脊髓，长度约4 cm，从损伤中心处迅速切开，依据实验检测需要一部分损伤脊髓组织置入4％多聚甲醛缓冲液中固定后4℃冰箱备用。组织病理学形态变化：经石蜡切片的制备，切片脱蜡至水、染色、脱水、透明、封片、镜检等步骤进行HE染色并镜下观察。

1.6 统计学处理应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，先进行方差齐性检验。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），多个样本均数之间的多重分析行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BBB运动功能评分比较见表1。BBB评分结果显示，Sham组未见运动功能评分降低。术后各时间点，ASCI组大鼠运动功能评分较其他组降低更明显，与Sham组比较均有统计学意义（P＜0.05）。与ASCI组相比，术后1 d、3 d的EA+MP组大鼠肢体运动功能降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。术后7 d、14 d，与ASCI组比较，EA+MP组大鼠肢体运动功能评分升高（P＜0.05）。以上结果表明，EA+MP组能改善大鼠脊髓损伤后肢体运动功能，且治疗时间长者治疗优势更加明显，疗效显著。

表1 各组大鼠神经功能比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能比较（分，±s）

与组内各时间点比较，▲P＜0.05；与ASCI组比较，△P＜0.05。

组别n 1 d3 d7 d14 d Sham组24 ASCI组24 21.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.00 1.17±0.411.50±0.842.67±1.214.33±1.51 EA+MP组241.50±0.55▲3.67±1.51▲7.17±0.75▲△12.00±1.55▲△

2.2 各组大鼠HE染色观察脊髓组织病理学形态变化比较HE染色结果显示，假手术组的4个时间点均可见细胞结构清晰，其中神经元形态较大，轴突明显。1 d的ASCI组细胞形态呈凋亡改变；EA+MP组，治疗组细胞形态改变类似，总体较ASCI组损伤程度轻，死亡神经元少于ASCI组。3 d的ASCI组大量细胞形态发生明显变化，呈凋亡细胞改变，神经元死亡数量增多；治疗组与ASCI组相比，组织病变程度减轻，细胞损伤有所缓解，神经元凋亡减少，可见的神经元形态较好。7 d的ASCI组呈现凋亡形态改变的细胞数量减少，神经元死亡数量下降，胶质细胞增生。14 d的ASCI组可见细胞坏死和空泡，炎性浸润，胶质细胞增生；EA+MP组正常神经元数量明显增多，治疗效果最为明显。见图1。

图1 各组大鼠的HE染色（200倍）

3 讨论

据近年相关文献报道［3］，夹脊电针配合MP治疗ASCI可有效改善肢体功能。从中医学讲，SCI后肢体瘫痪属“痿证”范畴［4-5］，督脉总督一身之阳气，膀胱经脉为十二经脉背俞穴会聚之所，夹脊穴在两经之间，既可通调督脉与膀胱经之气，又可平衡脏腑气血，疏通经气运行。在此基础上增加电针可增强刺激量，由于脊髓受损，气滞血瘀不能通达筋脉肌肉，气血失养而致痿症。夹脊电针可刺激腧穴，增强气血运行，以达到扶正祛邪、平衡阴阳之效。从现代医学角度分析，夹脊穴［6-8］位于脊神经后支，交感神经纤维通过交通支，分布到各个脏腑器官。夹脊电针［9-11］通过调节神经体液、释放化学物质、保护受损的神经细胞并改善细胞再生的微环境，从而减少细胞凋亡形态，减轻组织病变程度，以达到促进神经修复、改善肢体运动功能之效。脊髓损伤后局部微循环中［12-14］，前列腺素等产物释放造成严重的继发反应，而MP通过与体内糖皮质激素受体结合，减少系列产物的释放，减少细胞凋亡。二者联合治疗可明显改善大鼠肢体运动功能，并随着时间的延长，治疗效果越显著。从病理学形态角度分析，本研究治疗组1 d和3 d组，与ASCI组组间相比，夹脊电针配合甲强龙治疗后细胞形态学改变较小，细胞损伤较低，神经元死亡数量较低；7 d和14 d组中，治疗组与对照组比较，正常神经元数量明显增多，形态较好，结构较清晰，炎性细胞和胶质细胞数量减少，治疗组中以EA+MP组治疗效果最为明显，细胞恢复程度最佳，并随着时间延长效果愈加明显。

本研究通过对各组大鼠4个阶段的比较发现，EA+MP组的治疗效果最佳，并随着时间的延长，肢体功能改善愈明显。彭彬等通过观察采用夹脊电针治疗SCI后大鼠的运动功能评分发现，治疗组中的7 d组与14 d组比较，差异有统计学意义，说明夹脊电针治疗效果与时间呈正比关系［15］，与本研究结论相同。赵永青等采用MP对急性SCI神经元保护作用的实验研究中，对3 d、7 d、15 d和30 d 4个时间点进行观察，发现MP组随时间延长，损伤区内正常神经元和变化神经元的数量多于模型对照组，说明随着时间延长，对神经损伤的程度越轻［16］，其结论与本研究一致。

综上所述，夹脊电针配合MP治疗大鼠SCI可以明显改善大鼠运动功能，同时可有效减少对神经细胞的损伤，促进脊髓神经的功能恢复，并随着时间的延长，治疗效果愈显著。

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E xperimental Study on Time-effect Relationship of Jiaji Electroacupuncture and MP（Methylprednisolone）on Spinal Cord Tissue Pathomorphology in ASCI Rats

LI Xiaoning，SHAN Xiaochun，WU Lei，etal.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150001，China.

Objective：To study time-effect relationship of Jiaji electroacupuncture and MP（Methylprednisolone）on pathomorphology change of spinal cord tissue in ASCI rats.Methods：72 female Wister rats were randomly divided into sham operation group，ASCI group，and EA+MP group，and each group was divided into four subgroups：1 d，3 d，7 d and 14 d.BBB scores were observed to find the effects of different treatments on limb movement function of ASCI rats at different time points；HE staining was used to observe the pathological changes of spinal cord of ASCI rats at different time points；treatment effects at different time points in different groups were compared to select the best treatment plan.Results：BBB scores showed that on 3 d，7 d，14 d after operation，compared with the ASCI groups，limb movement function score increases in EA+MP groups（P＜0.05）.14 d group was better than 3 d group in EA+MP groups.HE staining results showed that on 1st day，ASCI groups had significant bleeding，and a large number of apoptotic neurons appeared；on 3rd day，there was the most obvious cell destruction；on 7th day，the apoptosis of nerve cells was decreased and the nerve cells were necrotic；on 14th day，apoptosis was not obvious，and there physalides existed.The injury of nerve cells in the treatment groups was significantly lower than that in ASCI groups，and the nerve cells were well preserved.Conclusion：Jiaji electroacupuncture and MP can improve the movement function scores of ASCI rats，meanwhile，reduce the apoptosis，and relieve spinal pathology morphological changes，and the effects are more obvious with the extension of time.

Acute spinal cord injury；Rats；Jiaji electroacupuncture；Methylprednisolone；Time-effect relationship；Emergency

R245.9+7

A

1004-745X（2017）06-0941-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.001

2017-03-25）

国家自然基金（面上）项目（81373715）；哈尔滨市应用技术研究与开发项目科技创新人才类优秀学科带头人B类（2016RAXYJ090）