家畜精(子)细胞染色方法的比较与评价

杨文祥，孙政国，金穗华

(1.江苏省兴化市动物卫生监督所，江苏 兴化 225700；2.南京农业大学，江苏 南京 210014；3.农业部牛冷冻精液质量检测中心(南京) 江苏 南京 210095)



家畜精(子)细胞染色方法的比较与评价

杨文祥1，孙政国2，金穗华3*

(1.江苏省兴化市动物卫生监督所，江苏 兴化 225700；2.南京农业大学，江苏 南京 210014；3.农业部牛冷冻精液质量检测中心(南京) 江苏 南京 210095)

为进一步提高家畜精子形态检验的科学性和客观性，本文结合种公畜精液生产和质量检验，对精子形态的检验应用姬姆萨染色法、考马斯亮蓝染色法和伊红—苯胺黑染色法进行了比较、分析。结果表明，三种方法中姬姆萨染色法对精子细胞的染色效果最好，可视精液质量检验的不同要求选择不同方法。

家畜; 精(子)细胞; 染色方法; 姬姆萨染色法; 考马斯亮蓝染色法; 伊红—苯胺兰染色法

家畜精液中精子所具有的生物学特性(质量性状)均与母畜受精有密切的关系[1]，其中精子形态是评价精液质量的一项必不可缺少的技术参数；而检验方法作为评价的技术手段，一直受到人们的关注。近年来对于精子形态检验方法的研究与探讨仍在继续，本文对于不同的检验方法的比较、分析，为进一步提高精液质量检验方法的科学性与正确性，提供相关的试验基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料

精液样品，来自国内各个家畜精液生产企业，涉及畜种有牛、猪和羊。

1.2 方法

1.2.1 姬姆萨染色法 姬姆萨染色液配制：见GB 4143中B5.2[2]，检验样品的取样、抹片、固定、染色、镜检和计算(形态异常率)的操作，按照GB 4143中附录B.5.3[2]。

1.2.2 考马斯亮兰染色法 高氯酸考马斯亮蓝染色液配制：取考马斯亮蓝R250(普通染料)50 mg，溶于100 mL蒸馏水，煮沸溶解，过滤后。加入高氯酸3.5 mL。

检验样品取样、抹片、固定、镜检和计算(形态异常率)的操作，按照GB 4143中附录B.5.3[2]，染色时间5～10 min。

1.2.3 伊红—苯胺兰染色法 伊红苯胺兰染液配制：分别取0.5%伊红染液和1%苯胺兰染液按照1︰2的比例混合。

取伊红苯胺兰染液5～10uL滴于载玻片的一端，另取等量精液与染液混匀后，立刻抹片，抹片操作见GB 4143中附录B.5.3[2]。

1.3 形态观察与 图像采集

染色样片自然晾干，在显微镜400～600倍和1000倍(油镜)下观察精子形态的染色效果(部分伊红—苯胺兰染色样片采用暗视野观察)，应用JD801精子图像分析软件进行拍摄和处理。

2 结果

2.1 图像比较

对公牛、种猪和绵羊精液用三种不同染色方法进行了取样染色，对精子图像观察选择了以形态(轮廓)、头部(顶体)、尾部(细胞膜)作为评价部位，具体见表1。

从表1中的精子形态图像比较看出，不同染色方法对精子的染色效果不尽一致。特别是对精子细胞膜的表现效果，姬姆萨染色效果最为理想。

3 讨论

3.1 染色方法

3.1.1 姬姆萨染色法 主要优点是染色后样片在显微镜下观察，精子呈深紫红色，底色为空白，不论400～600倍还是1000倍均可达到清晰观察精子形态变化的效果，特别是在1000倍油镜下对于精细胞质膜的变化，精子头部顶体结构是否异常、尾部质膜是否受损及受损程度，都可以清晰的鉴别和评价。肖婉芬等人应用对瑞氏-姬姆萨与巴氏染色法对精子形态染色效果的试验，结果表明：姬姆萨染色法是一种简单有效的精子形态染色方法[3]。目前，国内对于种畜精子形态的常规检验，在GB4143-84[2]、GB23238-2009[4]、GB20557-2006[5]等标准均明确应用姬姆萨染色法。

表1 不同染色方法的精子形态图像比较

3.1.2 考马斯亮兰染色法 在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝染色最为常用。国内有技术人员人试验用考马斯亮兰染色法对家畜精子作为快速染色和精子形态鉴别方法，样品染色后在显微镜下观察，精子为淡紫色，头部、顶体着色不明显，尾部颜色略深，染色效果与姬姆萨染色法比较，有不同结果的报道，主要是在对精子头部及顶体结构变化的鉴别。对人类精子形态的检测，采用考马斯亮兰染色法，高久春等用改良巴氏染色法、瑞-吉(姬)染色法和考马斯亮蓝染色法精液涂片染色，检测、计算形态正常精子率和顶体完整率，结论：瑞-吉(姬)染色法更适于顶体完整率判读[6]。

3.1.3 伊红—苯胺兰染色法 在上世纪八十年代曾作为精液中活精子计数方法之一，其原理是利用活精子对特定染料不着色的特点来区分计算死、活精子的比例；显微镜下观察，活精子不着色(无色)，死精子呈粉红色，苯胺黑(兰)为背景衬托，以此作为目测评定精子活力的校正参考。以后有人提出甘油对精子着色有干扰，使精子可渗透性增加，着色精子增多，不便用于冷冻精液的精子形态鉴别[7 ]。以后对于精子细胞的染色、观察应用不多，近期有人提出以此作为精子形态检验的快速染色方法，在试验中，400～600倍和1000倍下观察，精子形态的轮廓可以看到，但对于精细胞膜的变化，特别是头部、顶体部和尾部细胞膜的损伤和缺陷，与姬姆萨、考马斯亮兰染色法比较，难以清晰显示。在高倍镜下观察时，精子未着色形态难以鉴别，特别是顶体部位不宜区分。Oral[8]等认为未着色的精液涂片仅适用于分析形态正常精子。《WHO人类精液分析与处理实验室手册》第5版推荐的精子存活率试验方法分别是伊红Y染色法、伊红-苯胺兰染色法和低渗膨胀试验，目前也多用于死、活精子的染色，少有用于精子形态的检验。

3.1.4 染色技术要求与质量控制 对于精子形态检验染色方法的选择，应是操作过程简单，能够获得最佳色效果，保证精子形态检验的准确性。在染色过程中，应注意对精子有最大保护，避免某些染色液(试剂)、温度、pH值、渗透压等物理因素对精子形态的损伤。

4 结论

任何染色方法的选择是根据最终需要的染色效果决定的。试验表明，以上三种染色方法均可作为检验精子形态的染色方法。姬姆萨染色法精子各部位着色效果好，特别是精细胞的质膜和精子的头部(顶体及核部位)、颈、尾部线粒体容易鉴别，而且染色简便,目前仍是实验室追求高质量精子形态学检验的首选。

[1] 秦和春，金穗华.牛精液质量与受精率的关系[J].畜牧与兽医,2007.39(4)：29-30.

[2] 牛冷冻精液GB4143-84[S].北京：中华人民共和国标准化委员会.

[3] 肖婉芬,等.瑞氏-姬姆萨与巴氏染色法对精子形态染色效果比较[J].华中医学杂志,2007.31(6)：436-438.

[4] 种猪常温精液GB23238-2009[S].北京：中华人民共和国标准化委员会.

[5] 山羊冷冻精液GB20557-2006 [S].北京：中华人民共和国标准化委员会.

[6] 高久春，王瑞雪,等.精子形态学分析中染色方法的比较[J].吉林大学学报医学版,2005.31(05)：778-780.

[7] 冯建超.家畜繁殖技术进展[M].重庆：科学技术文献出版社重庆分社，1979：17-18.

[8] Oral E,Yetis O ,Elibol F,etal.Assessment of human spermmorphology by strict criteria:comparison of wet preparationversus stained with the modified Diff-Quik method[J] ArchAndrol,2002,48(4):307-314.

Comparison and Evaluation on Staining Methods of Livestock Sperm Cell

YANG Wen-xiang1,SUN Zheng-guo2,JIN Sui-hua3*

(1.XinghuaAnimalHealthSupervisionInstitute,Xinghua,Jiangsu,China225700; 2.CollegeofPratacultureScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,China210095; 3.QualitySupervisionandTestCenterofFrozenBovineSemenofMinistryofAgriculture(Nanjing),Nanjing,China210095)

In order to furtherimprove thecorrection and objectivity of morphology test of livestock sperm cell,three staining methods applied in the examination and test of livestock sperm morphology,namely Giemsa staining method,Coomassie blue staining method and eosin-nigrosine blue staining method,were analyzed and compared in this research,connecting with sire semen production.It is concluded that the staining effect by the Giemsa staining method was the best among the three methods,and the staining method could be selected in terms of the different requirements of the examination and test of semen quality using this method.

livestock;sperm cell;staining method;giemsa staining method;coomassie blue staining method;eosin-nigrosine blue staining method

7-03-06

2017-03-20

江苏省农业三新工程项目(SXGC[2014]246)

杨文祥(1967-)，男，高级兽医师，主要从事畜牧兽医技术推广工作。

S814

A

1001-9111(2017)03-0024-03

*通讯作者：金穗华 (1948-)，男，江苏南京，高级畜牧师，主要从事家畜繁殖与家畜精液质量检验技等方面的研究。