肿瘤坏死因子-α表达与脑出血患者神经细胞凋亡的相关性研究

卢艳秋 常克亮 王生锋 刘晓静 刘小军

郑州大学第二附属医院重症医学科，河南 郑州 450014

肿瘤坏死因子-α表达与脑出血患者神经细胞凋亡的相关性研究

卢艳秋 常克亮 王生锋 刘晓静 刘小军

郑州大学第二附属医院重症医学科，河南 郑州 450014

目的 探讨脑出血患者炎性因子表达与细胞凋亡的关系。方法 选取脑出血患者48例，登记临床资料并检测血肿周围脑组织TNF-α的不同时间段的表达。测定TNF-α表达：(1)Western Blot法；(2)免疫组化法。测定细胞凋亡：TUNEL法。结果 TNF-α的表达高峰期为0～24 h、13～48 h，TUNEL法测定神经细胞凋亡高峰期为13～48 h，表明脑出血后神经细胞凋亡与TNF-α的表达高峰完全一致，存在时间变化规律一致性。以凋亡细胞数为纵轴，TNF-α表达阳性细胞数为横轴制作散点图。胞质TNF-α阳性细胞数与凋亡细胞数相关系数r为0.954，呈明显正相关。结论 脑出血患者血肿周围脑组织TNF-α表达水平与神经细胞凋亡数一致。

TNF-α；脑出血；神经细胞；凋亡

神经细胞的凋亡是脑出血后继发性损害的主要表现形式，也是神经功能损害的主要诱因，能够促进神经功能损伤的进行性发展[1]。炎性反应是脑出血后继发性神经损伤的重要作用机制，研究表明，NF-κB对多种炎性细胞因子的阳性表达水平、炎症反应发展及神经细胞损伤具有至关重要的作用[2]。TNF-α作为NF-κB的下游因子是炎性反应过程的重要参与元素[3]。本研究旨在观察48例脑出血患者的临床资料及血肿周围脑组织TNF-α的时间表达规律和神经细胞凋亡的时间周期规律，探讨炎性因子TNF-α表达与神经细胞凋亡的关系。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选取2013-11—2015-11郑州大学第二附属医院神经外科收治的脑出血患者48例为研究组，男29例，女19例，年龄32～73岁，术前GCS评分13～14分5例，9～12分29例，3～8分14例。选取同期收治的需皮层造瘘行脑室手术治疗的良性疾病患者10例为对照组，男6例，女4例，年龄29～70岁。所有研究标本均为正常手术中血肿周围破碎脑组织。研究组取皮层造瘘距离血肿周围1 cm处脑组织，对照组取皮层瘘口通道灰白质交界处的脑组织。

1．2 方法

1．2．1 研究组：根据术中取材时间与初发病时间间隔，将研究组分为6组各8例：0～6 h为1组，7～12 h为2组，13～24 h为3组，25～48 h为4组，49～96 h为5组，>96 h为6组。

1．2．2 Western Blot法：①预实验检测方法可信度；②提取细胞核蛋白、胞浆蛋白；③配制SDS-PAGE胶；④转膜；⑤免疫反应；⑥化学发光、显影、定影；⑦1D Image Analysis Software定量分析。

1．2．3 免疫组化法：制作石蜡切片行HE染色，然后按试剂盒步骤进行免疫组化检测，于400倍高倍显微镜下观察，随机选择5个无重复视野，进行TNF-α阳性细胞计数，以总和阳性细胞数作为测量值。

1．2．4 测定细胞凋亡：采用TDT介导下的dUTP缺口末端标记测定法(即TUNEL法)测定细胞凋亡水平。

2 结果

2．1 Western Blot法测定各组TNF-α表达水平及时间变化比较 TNF-α出血后表达水平显著升高，研究组3组TNF-α表达水平为最高峰，与4组表达水平差异无统计学意义(P3/4>0.05)，与其他各研究组比较差异有统计学意义(P1/3、P2/3、P3/4<0.05)。见表1。

表1 各组TNF-α表达水平比较

2．2 免疫组化法测定TNF-α的表达水平及时间变化比较 研究组4组TNF-α阳性表达细胞数最多，与3组比较差异无统计学意义(P3/4>0.05)，与其他各研究组比较差异均有统计学意义(P2/4<0.05，P1/4、P4/5<0.01)。出血后13～48 h为TNF-α的表达高峰期。见表2。

表2 免疫组化法测定TNF-α表达水平

2．3 TUNEL法测定血肿周围脑组织神经细胞凋亡情况及时间变化 研究组样本在光镜下查见大量棕色凋亡细胞，而对照组中凋亡细胞极为罕见。提示研究组神经细胞凋亡数显著多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 TUNEL检测法测定研究组及对照组脑组织神经细胞凋亡情况

2．4 细胞凋亡与TNF-α表达水平的关系 TNF-α的表达高峰期为13～48 h，Western Blot法及免疫组化法测定结果一致。TUNEL法测定神经细胞凋亡高峰期为13～48 h，表明脑出血后神经细胞凋亡与TNF-α的表达高峰完全一致。以凋亡细胞数为纵轴，TNF-α表达阳性细胞数为横轴制作散点图。胞质TNF-α阳性细胞数与凋亡细胞数相关系数R为0.954，呈明显正相关。见图1。

图1 胞浆TNF-α阳性细胞数

3 讨论

炎性因子是一种高生物活性的小分子多肽，TNF-α可启动细胞因子系统进一步诱发机体代谢异常、血管通透性、血流动力学异常等过程。胡利华等[4]研究显示，脑出血后TNF-α的表达水平即显著升高，TNF-α阳性表达细胞数增多。赵卫海等[5]发现脑出血后血肿周围脑组织TNF-α阳性表达水平与炎性细胞数呈正相关。

本研究结果表明，TNF-α的表达高峰期分别为0～24 h、13～48 h，Western Blot法及免疫组化法测定结果一致。TUNEL法测定神经细胞凋亡高峰期为13～48 h，表明脑出血后神经细胞凋亡与TNF-α的表达高峰完全一致，以凋亡细胞数为纵轴，TNF-α表达阳性细胞数为横轴制作散点图，胞浆TNF-α阳性细胞数与凋亡细胞数呈明显正相关。

本研究结果印证了脑出血后神经细胞凋亡与TNF-α蛋白质表达水平、mRNA表达等因素有关，而神经细胞凋亡情况与脑出血患者远期预后、神经功能损伤水平有关，因而调控、阻断、降低IL-1β、TNF-α的蛋白质表达水平、mRNA表达及转录可能对降低神经功能损伤严重程度或改善脑出血患者远期预后有重要意义。但本研究例数相对较少，存在一定局限性，有待大规模临床研究进一步证实相关结论。且本研究结果提示，未来研究方向应针对采用特异性活性抑制剂、RNA干扰剂、RNA抑制剂、蛋白质抑制剂及基因表达阻断等相关技术阻断或降低TNF-α的阳性表达水平，以期探索更为针对有效治疗脑出血患者神经功能损伤的治疗手段。同时，应进一步研究TNF-α等炎性因子对神经细胞凋亡的作用机制，为治疗手段研究奠定基础。

[1] Chen J，Wang L，Wu C，et al．Melatonin-enhanced autophagy protects against neural apoptosis via a mitochondrial pathway in early brain injury following a subarachnoid hemorrhage[J]．J Pineal Res，2014，56(1)：12-19．

[2] Zhou C，Xie G，Wang C，et al．Decreased progranulin levels in patients and rats with subarachnoid hemorrhage：a potential role in inhibiting inflammation by suppressing neutrophil recruitment[J]．J Neuroinflammation，2015，12：200．

[3] 陈光丑．颅脑损伤早期血清炎性细胞因子的变化与预后关系分析[J]．浙江创伤外科，2014，19(6)：889-891．

[4] 胡利华，吴江，杜丹华，等．实验性脑出血急性期灶周组织水肿及炎性细胞因子的表达[J]．中风与神经疾病杂志，2006，23(5)：552-554．

[5] 赵卫海，海陈炼，余国栋．血清TNF-α IL-1 IL-6 IL-8在急性颅脑损伤后含量变化及意义[J]．中国实用神经疾病杂志，2013，16(16)：22-23．

(收稿2017-03-14)

R743.34

A

1673-5110(2017)12-0062-02