尤力克柠檬与四倍体夏橙杂交幼胚试管培养试验初报

罗君琴 柯甫志 王平 聂振朋 徐建国 孙建华

(浙江省柑橘研究所 台州 黄岩318020)

试验研究

尤力克柠檬与四倍体夏橙杂交幼胚试管培养试验初报

罗君琴 柯甫志 王平 聂振朋 徐建国 孙建华

(浙江省柑橘研究所 台州 黄岩318020)

世界各国十分重视柑橘育种，三倍体无籽育种一直都是各育种专家比较重视的柑橘育种方向之一。利用二倍体与四倍体进行有性杂交仍是目前柑橘获得三倍体育种材料的重要途径，但柑橘二倍体作母本与四倍体材料人工授粉受精后产生的三倍体杂种胚在杂交果实生长发育途中极易败育，与此同时杂种胚的获取亦容易受二倍体母本胚性干扰。利用幼胚试管培养技术[1～3]可有效克服柑橘二倍体作母本与四倍体杂种胚败育问题，及有助于直接分离单、多胚不同胚性的杂交胚，深入研究二倍体母本与四倍体杂种幼胚试管培养技术对提高三倍体杂种后代的获取概率及获取更丰富的遗传育种材料意义较大。

1 材料与方法

本研究以浙江省柑橘研究所种质资源圃中二倍体尤力克柠檬为母本，四倍体夏橙为父本，连续两年于4月中下旬进行人工杂交授粉。授粉后10d去杂交袋，2个月后开始定期采集杂交果无菌条件下取幼胚于24± 2℃、2000lux光强、12h/d 模拟光照条件下开展试管离体培养技术研究。试验以MT为基本培养基，主要从不同杂种胚龄、培养基生长调节剂配方方面来探讨关键影响因子对尤力克柠檬×四倍体夏橙杂交幼胚试管离体培养成活及成苗影响。

2 结果与分析

2.1 不同胚龄对杂交幼胚试管离体培养叶状胚及成苗诱导影响

父母本树授粉后60d开始每隔8～10d，直至授粉后130d，各时间点分别采集杂交果实,取幼胚离体接种于以MT 为基础培养基、相同植物调节剂配方诱导培养基中，并于相同光温控制条件下培养。在最后一批幼胚组培接种后76d，分别观察统计不同胚龄各试验小组离体培养叶状胚产生比率及诱导成苗情况，结果如表1所示。

表1 杂交种胚不同胚龄试管内离体培养叶状胚与成苗诱导情况

从表1可以看出，授粉后60d最早采集的幼胚试管培养仅有2.6%的叶状胚产生，没有诱导成苗；授粉后70d 杂交果幼胚离体培养的外植体叶状胚和小苗产生率略有增加，但仍然很低。而至授粉后80d 成苗率可快速递增，高达49.5%；授粉后90d、98d、106d幼胚离体培养诱导成苗率稳定在48.6%～50.0%之间，且仍存在13.7%～14.0%的叶状胚产生比率，可保持较好的芽诱导分化能力。授粉后114d 开始幼胚离体培养成苗率随着胚龄的增加明显下降，授粉后114d、122d、130d幼 胚 试管 培 养成 苗 率 分 别 降 为19.7%、12.3%、5.7%，且叶状胚产生比率均很低，芽诱导分化潜力较差。诱导试验直观结果结合原始数据LSD0.01分析比较，均表明授粉后80d至106d 是尤力克柠檬×四倍体夏橙杂交幼胚试管离体培养适宜胚龄。

2.2 培养基生长调节剂配方对杂交幼胚试管离体诱导成苗影响

采用正交试验初步分析、筛选不同植物生长调节剂种类及浓度对尤力克与四倍体夏橙杂交幼胚试管成苗影响。试验设3个影响因子，分别为KT、IBA和GA。每个因子3个水平，KT对应的3个水平分别为1.0、2.0、3.0mg/l；IBA对应的3个水平分别为0.3、0.9、1.5mg/l；GA对应的3个水平分别为0.0、0.2、0.4mg/l。每个组合处理接种30个授粉100d杂交果幼胚，重复2次。接种培养2个月后观察记录杂交幼胚成苗情况，记录分析不同植物生长调节剂对尤力克与四倍体夏橙杂交幼胚试管成苗的影响，试验结果如表2所示。

从表2正交试验极差分析结果可以看出KT、IBA、GA 三种植物生长调节剂对幼胚诱导成苗影响大小依次为：KT＞IBA＞GA。

为进一步明确KT、IBA和GA三个试验因子对杂交幼胚组培离体培养成苗率的影响，对试验结果数据进行了方差分析，结果如表3所示。

表2 不同植物生长调节剂及浓度对杂交幼胚离体培养成苗率影响

表3 不同植物生长调节剂及浓度对杂交幼胚离体培养成苗率影响方差分析

从表3中F值可以看出，KT、IBA、GA3个试验影响因子对尤力克与四倍体夏橙杂交幼胚试管成苗诱导的影响未达显著水平。结合表2直观分析，进一步明确了本次试验可 优 选 平 均 数 大 的 水 平KT2.0mg/L、IBA0.3mg/L和GA0.2mg/L(即MT+KT2.0mg/L+ IBA0.3mg/L+GA0.2mg/L)组合配方为尤力克与四倍体夏橙杂交幼胚试管离体培养较适配方。

3 小结

本试验中，尤力克柠檬×四倍体夏橙杂交授粉后80d至106d 幼胚试管离体培养成苗率、叶状胚产生率明显高于80d前与106d后胚龄。试验进一步验证了利用柑橘杂种幼胚试管培养技术可提前赶在合子胚败育前创造良好的光、温、湿及营养环境离体成功培养各杂种幼胚成苗，有效克服柑橘二倍体作母本与四倍体杂种胚败育问题。同时，接种培养前去除种胚内外种皮可直接有效分离单、多胚，实现培养前期杂交胚初选，既提高获取三倍体杂种后代的概率，又减少组培工作量，目前仍不失为单、多胚杂交组合三倍体育种杂种后代有效的培养途径。试验利用正交实验设计初步筛选出尤力克与四倍体夏橙杂交幼胚离体诱导培养基较适配方，可作为相近柑橘种属亲本杂交幼胚离体培养参照配方。

[1]谭洪泉，陈善春.柑橘杂种胚挽救及早期鉴定[J].安徽农业科学，2011，39（15）：8901～8903，8999

[2]郭文武，伊华林，邓秀新.离体培养与柑橘三倍体育种[J].中国南方果树，1997，26(6)：11～13

[3]伊华林，邓秀新，付春华.胚抢救技术在果树上的应用.2001，18（4）：224～228

10.13906/j.cnki.zjgj.1009-0584.2017.02.540

2017-5-18

台州市科技项目（编号：14ny09）