亮氨酸氨肽酶-3(LAP3)在非小细胞肺癌中的表达

贾亮亮 崔学范



及临床意义

亮氨酸氨肽酶-3(LAP3)在非小细胞肺癌中的表达

贾亮亮1崔学范2

亮氨酸氨肽酶-3； 非小细胞肺癌； 免疫组织化学； 总生存期

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，在发达国家中，肺癌导致的死亡率居于所有恶性肿瘤的首位[1-2]。非小细胞肺癌占所有肺癌患者80%以上，虽然经过数十年的探索和研究，肺癌的预后，尤其是非小细胞肺癌的预后，依然不容乐观[3]，患者的5年存活率依然很低，不超过15%[4]。造成这种预后不良的主要原因是由于确诊的时候大多处于肿瘤的晚期。因此，如果有新的生物标志物可以发现早期肺癌，将有助于肺癌的早期诊断和治疗。

亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidases, LAPs)，是一类含锌的金属酶，可以催化氨基酸N末端的多肽的裂解，从而促进肽键的水解[5]；其功能是参与细胞内蛋白质降解的终末环节，通过泛素-蛋白酶体途径将蛋白质裂解为小分子肽参与抗原呈递，或全水解为游离氨基酸用于新的蛋白质的合成[6]。此外，LAPs是诸如蛋白质成熟、肽的降解和细胞周期控制等生理重要过程中必不可少的[7]。Rutenburg等[8]研究表明胰腺癌患者血清和尿液中LAP活性显著升高，恶性淋巴瘤和白血病患者尿液中LAP活性升高；Willighagen和Planteydt[9]发现在外科手术切除的人类肿瘤组织中LAPs表达增高在肿瘤细胞核基质中；研究表明，在食管鳞状细胞癌和肝细胞癌中LAP3促进肿瘤的生长[10]。但是，非小细胞肺癌和LAP3的关系尚不清楚。

本实验采用免疫组化研究LAP3在手术切除的非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁正常组织中的表达，探讨LAP3表达与生存率及临床病理参数如吸烟、性别、年龄、TNM分期及分化程度等之间的关系。

对象与方法

一、研究对象

收集南通大学附属医院2005年8月至2008年7月间收治的经过临床病理确诊、临床随访资料完整的NSCLC患者137例。随访1～70个月，其中男性66例，女性71例；患者年龄35～82岁，中位年龄60岁；临床分期按2009版非小细胞肺癌TNM标准分期：Ⅰ期92例，Ⅱ期30例，Ⅲ期15例；分化程度分级：低分化17例，中分化92例，高分化28例；有淋巴结转移者52例，无淋巴结转移者85例。所有病例均未行术前化疗、放疗，并从肿瘤远端(至少5 cm处)取相应癌旁组织并经病理证实为正常肺组织作为对照。标本取材后一部分贮存于-80 ℃冰箱中备用；一部分放置于4%的福尔马林溶液中固定，做成石蜡切片备用。

二、研究方法

1. 组织中蛋白的提取及Western blot反应：取出NSCLC组织及其配对癌旁正常组织，匀浆，重悬于8倍体积的RIPA裂解液中，置于冰上裂解30 min。4 ℃，以离心半径8 cm，12 000 r/min离心20 min后取上清，测定蛋白浓度。聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，分离之后采用电泳法转移至PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭1 h，加入LAP3抗体(1︰500，Santa Cruz Biotechnology)和抗GAPDH抗体(1︰1 000)，4 ℃孵育过夜。PBST洗膜3次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1︰3 000)室温孵育2 h，常规洗膜，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定。

2. 免疫组化及结果判定：将石蜡组织连续制成4 μm厚度的切片，并在65 ℃烤30 min备用。采用免疫组化染色二步法，石蜡切片脱蜡、水化后，高温抗原修复，过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性，山羊血清工作液封闭。抗LAP3的抗体(1︰50，Abgent)和抗Ki-67的抗体(1︰50，Santa Cruz Biotechnology)在4 ℃冰箱中孵育过夜，IgG为阴性对照。滴加二抗，DAB染色，苏木精复染。LAP3免疫组化阳性信号定位于胞浆，Ki-67阳性信号定位于胞核。每个切片随机选5个高倍镜视野，每个视野至少500个细胞，根据细胞着色范围和着色强度进行评分。着色范围评分如下：0分(阳性肿瘤细胞<10%)、1分(阳性肿瘤细胞在10%～30%之间)、2分(阳性肿瘤细胞在30%～50%之间)、3分(阳性肿瘤细胞在50%～70%之间)、4分(阳性肿瘤细胞>70%)。着色强度评分如下：0分(无着色)、1分(淡染)、2分(黄色颗粒)、3分(棕褐色颗粒)。根据着色范围和着色强度的成绩将LAP3分为低表达组(0～4分)和高表达组(5～12分)

三、统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件，对LAP3表达和临床病理因素的关系用卡方检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、LAP3蛋白在NSCLC组织及配对癌旁正常组织中的表达

采用Western blot技术检测NSCLC及其配对癌旁正常组织中LAP3蛋白的表达量。结果显示NSCLC组织中LAP3蛋白的表达量(0.89±0.04)明显高于癌旁正常组织(0.13±0.01)(P<0.05，图1)，提示LAP3在NSCLC发生发展中有重要作用。

图1 LAP3蛋白在NSCLC组织及配对的癌旁正常组织的表达

二、NSCLC中LAP3蛋白表达与临床病理特征的关系

采用免疫组化SP法检测LAP3蛋白在137例NSCLC组织及其癌旁正常组织中的表达。LAP3在正常肺泡上皮组织中未着色，在肿瘤组织中阳性信号定位于胞质中，见图2。对临床病理因素进行分析发现LAP3蛋白的表达与年龄、性别、肿瘤大小、吸烟等无相关，见表1。但有淋巴结转移的肺癌组织中LAP3阳性率明显高于无淋巴结转移者(P=0.001)，Ⅰ+Ⅱ期患者LAP3的阳性明显低于Ⅲ期患者(P=0.001)，高分化的NSCLC患者中LAP3的阳性率低于低分化+中分化患者(P=0.005)。

图2 正常肺泡上皮组织；注:(A)和NSCLC组织(B)中LAP3蛋白的表达 IHC(×400)

三、LAP3表达的生存分析

137例随访结果显示，LAP3高表达的患者比低表达的患者有更长的总生存期，其差异有统计学意义(P<0.001，图3)。结果表明，LAP3是NSCLC患者总生存期的独立预后因子。

图3 NSCLC患者中LAP3蛋白高表达和低表达的生存曲线比较

表1 LAP3表达与NSCLC患者临床病理特征之间的关系

讨 论

癌症的发生和发展是多基因共同作用的结果，与癌基因的激活和抑癌基因的失活等遗传因素有关，同时受多种环境因素的影响[11]。DNA损伤修复机制的异常和细胞周期调控紊乱是恶性肿瘤发生发展的重要机制[12]。LAPs是诸如蛋白质成熟、多肽的降解及细胞周期调控等重要生理过程中必不可少的，癌细胞的生长和增殖依赖于LAPs所分解产生的游离氨基酸。先前的研究表明LAPs的异常表达与人类的许多癌症相关，例如子宫内膜癌、卵巢上皮恶性肿瘤等[13]。本研究中LAP3与NSCLC组织的分化程度、淋巴结转移、TNM分期密切相关。Kaplan-Meier生存分析结果表明，LAP3高表达组比低表达组总生存时间明显下降，表明LAP3高表达与NSCLC患者的不良预后有关，是影响患者预后的独立危险因素。

综上所述，LAP3表达在NSCLC组织和癌旁正常组织中存在差异，LAP3可能与NSCLC的发生、发展有关。LAP3蛋白表达在NSCLC中的临床病理和预后的意义表明，LAP3低表达组比高表达组有更长的生存期，并且LAP3表达是影响NSCLC预后的独立因素。LAP3蛋白在NSCLC中的发生发展过程中具有重要的作用，为非小细胞肺癌的研究提供了新的思路和方向。

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(本文编辑：黄红稷)

贾亮亮，崔学范. 亮氨酸氨肽酶-3(LAP3)在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(3)： 329-331.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.020

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R563，R734.2

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2016-03-14)