胰岛素样生长因子-1可促进油酸诱导急性肺损伤小鼠纤维化及可能机制

刘峰 黄华萍 陈明净 李羲 刘美花 王杰



胰岛素样生长因子-1可促进油酸诱导急性肺损伤小鼠纤维化及可能机制

刘峰1黄华萍1陈明净2李羲1刘美花1王杰1

目的探讨胰岛素样生长因子(IGF)-1在急性肺损伤小鼠肺纤维化发病机制中的作用。方法健康BALB/c小鼠60只，随机分为油酸组(n=35)和对照组(n=25)。油酸组从尾静脉注入0.3 ml/kg的油酸, 对照组从尾静脉注入同等体积的生理盐水；两组分别于8 h、1、3、7、14、21、28 d各处死3只小鼠，取右肺用于qRT-PCR 法检测IGF-1 和IGF-1R mRNA 表达水平，Western Blotting 检测IGF-1、IGF-1R蛋白表达水平，免疫组织化学法检测IGF-1、IGF-1R和胶原Ⅰ/Ⅲ，α-平滑肌肌动蛋白，CD68和增殖细胞核抗原阳性细胞数；取左肺用于HE和Masson染色观察肺组织的病理改变。结果油酸组小鼠第1～28天肺组织中IGF-1、IGF-1R mRNA、蛋白表达水平和阳性细胞数逐步升高，第21天达高峰，第28天缓慢下降；胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白、CD68和增殖细胞核抗原阳性细胞数随时间持续升高，第21天后升高势头趋向平缓；与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。油酸组小鼠第1～3天病理特征为明显肺泡炎性改变，第7～21天肺泡炎性改变减轻，纤维增生明显，支气管周围、肺泡间隔及肺泡腔内出现纤维化，第28天纤维增生趋向于平缓。结论胰岛素样生长因子-1可能通过促进胶原Ⅰ和胶原Ⅲ以及α-平滑肌肌动蛋白、CD68和增殖细胞核抗原的生成、增加肺间质胶原的沉积、加重肌成纤维细胞的增殖，促进急性肺损伤小鼠肺纤维化。

油酸； 急性肺损伤； 肺纤维化； 胰岛素样生长因子-1； 胰岛素样生长因子-1

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭的一种疾病[1-3]。各种病因所致的ARDS病理变化基本相同，可以分为渗出、增生和纤维化三个相互关联和部分重叠的阶段。一般损伤经过1～3周以后，逐渐过渡到纤维化增生阶段，出现病理的不可逆，死亡率也因此明显升高。据统计，ARDS占全球ICU入院患者的10%，病死率持续超过40%[4-5]。众多研究表明，细胞因子在ARDS肺纤维化的发生发展中起着重要的作用，并通过旁分泌介导细胞-细胞间作用，或通过自分泌的形式作用于自身，构成一个庞大而相互制约、相互协作的网络系统[6]。我们的前期研究结果显示，在油酸诱导急性肺损伤小鼠模型中，血清胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)水平随损伤时间而递增，其变化趋势与肺组织病理的纤维化进程一致，提示IGF-1在 ARDS的发病过程中起到了重要的作用，并可能促进了其纤维增生的进程[7]，但其作用具体机制尚未明确。本实验旨在探讨IGF-1在ARDS肺纤维化发病机制中的作用，进而为后续探索ARDS新的治疗途径供理论基础。

材料与方法

一、实验材料

选择SPF 级健康BALB/c小鼠，体重20～25 g，6～8周龄，由南方医科大学实验动物中心提供。实验试剂: 油酸购自上海阿拉丁生化科技股份公司。Trizol试剂为TAKARA公司产品，RNA逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒为DBI公司产品。BCA蛋白浓度测定试剂盒为美国Pierce公司产品。免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺( DAB) 显色液为美国DAKO公司产品。

二、研究方法

1. 动物分组及模型制备： 健康BALB/c小鼠60只，雌雄不拘，适应性饲养1周，实验前禁食禁饮12 h。按照随机数字表法分为油酸组(35只)和对照组(25只)。油酸组从尾静脉注入0.3 ml/kg的油酸[7]，对照组从尾静脉注入同等体积的生理盐水。两组分别于8 h、1、3、7、14、21、28 d各处死3只小鼠，然后剩下的小鼠继续饲养至实验结束。断颈法处死小鼠，剪下整个肺脏，左肺用于病理学观察，右肺用于qRT-PCR 检测IGF-1 和IGF-1R 的mRNA 表达水平,免疫组织化学法和Western Blotting 检测IGF-1、IGF-1R 和胶原Ⅰ/Ⅲ，α-平滑肌肌动蛋白，CD68和增殖细胞核抗原的表达水平。

2. 肺组织病理学评价： 取小鼠左肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，制片后行苏木精-伊红(HE)及Masson 染色，在光学显微镜下参照文献[8]，对肺泡、间质炎症性改变、出血、肺不张、肺水肿及间质纤维化分别进行评分。HE染色评价肺泡炎性改变程度，按程度及范围不同分为4 级，0 级-无肺泡炎；1级-轻度肺泡炎，病变区域小于全肺的20%，肺泡结构正常；2 级-中度肺泡炎受累面积占全肺的20%～50%；3 级-弥漫性肺泡炎，病变范围>50%。分别以0，1，2，3 分表示。Masson 染色评价肺纤维化程度，记录肺纤维化在切片中所占的比例，以百分比表示。

3. qRT-PCR法检测小鼠肺组织中IGF-1 mRNA和IGF-1R mRNA 表达： 取右肺下叶, 采用Trizol法提取肺组织总的RNA ,逆转录成cDNA ，以β-actin为内参，进行qRT-PCR 检测IGF-1 和IGF-1R 的mRNA表达水平。PCR引物由生工生物(Sangon Biotech)公司设计并合成。IGF-1 上游引物序列5′-ATGGCTCCAGGGTTTCTTTA-3′，下游引物序列5′- AATAGCACCACATTGGCGTA-3′，产物长度116bp；IGF-1R 上游引物序列5′-ACCGGGATCTCATCAGCTTC-3′，下游引物序列5′-TCCTTGTTCGGAGGCAGGTCA-3′，产物长度277bp；β-actin上游引物序列5′-CATTGCTGACAGGATGCAGA-3′，下游引物序列5′- CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3′，产物长度139bp。反应条件为: 95 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，循环40次。

4. Western Blotting 法检测小鼠肺组织IGF-1、IGF-1R蛋白的表达水平： 取小鼠肺组织40 mg剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.5 ml裂解液严格按照说明书进行蛋白提取，然后采用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白，变性后垂直电泳，电转至PVDF膜，放入封闭液中5%脱脂奶粉-TBS，室温封闭1 h，分别加入稀释一抗溶液IGF-1(稀释比例1︰800，转膜条件：300 mA恒流转膜17 min)抗体、IGF-1Rα(稀释比例1︰500，转膜条件：300 mA恒流转膜15 min)抗体或GAPDH 5%脱脂奶粉-TBS，置于摇床上室温平缓摇动1 h，洗涤PVDF膜3次，然后将PVDF膜放入含有3ml辣根过氧化物酶标记的稀释二抗溶液的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动40 min(二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG、HRP Rabbit anti-Mouse IgG为BOSTER厂家产品)，重复洗涤3次。化学发光、显影、定影。采用凝胶图象处理系统Image-Pro Plus 6.0分析条带净光密度值。

5. 免疫组织化学法检测小鼠肺组织中IGF-1、IGF-1R和胶原Ⅰ/Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白、CD68和增殖细胞核抗原的表达水平： 小鼠肺组织石蜡切片经脱蜡至水，置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，然后放入3%过氧化氢溶液(双氧水︰纯水=1︰9)，室温避光孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶；10%正常兔血清室温封闭30 min；加一抗，于湿盒内4 ℃孵育过夜；加二抗，室温孵育50 min；DAB显色(显微镜下控制显色程度)；Harris 苏木素复染；滴加水性封片剂，干燥后中性树胶封片；显微镜镜检，并作图像采集分析。以阳性细胞计数表示IGF-1、IGF-1R和胶原Ⅰ/Ⅲ、平滑肌肌动蛋白、CD68和增殖细胞核抗原的表达水平。阳性细胞计数：在400倍光学显微镜下分别随机选取5个视野，分别计数免疫反应阳性的细胞数。

三、统计学方法

结 果

一、两组小鼠肺组织的病理变化

HE染色显示，对照组小鼠肺组织结构正常。油酸组小鼠第1～3天出现肺泡炎性改变，炎性细胞浸润，肺泡上皮增生，肺泡间隔增宽，血管充血明显，肺泡腔内充满水肿液、部分肺泡出血；第7天后炎症减轻，组织开始增生，Masson 染色可见成纤维细胞增殖，蓝绿色胶原纤维首先出现在支气管周围、肺泡间隔，接着于肺泡内出现。第28天纤维增生趋向平缓。油酸组与对照组进行组间比较，各时间段肺泡炎和肺纤维化明显升高，差异有统计学意义(P=0.001和P=0.000)。油酸组不同时间点比较，肺纤维化程度第14天较第7天有升高，但差异无统计学意义(P=0.374)；第21天较第7天有升高，且差异有统计学意义(P=0.007)；第28天较第21天有升高，但差异无统计学意义(P=0.158)，见表1。

二、两组小鼠肺组织中IGF-1mRNA和IGF-1R mRNA表达水平

油酸组小鼠肺组织中IGF-1mRNA和IGF-1R mRNA表达水平显著高于对照组(P=0.000和P=0.000)。油酸组不同时间点比较，IGF-1mRNA第14天较第7天有升高，但差异无统计学意义(P=0.568)；第21天较第7天有升高，且差异有统计学意义(P=0.008)；第28天较第21天有下降，但差异无统计学意义(P=0.077)。油酸组不同时间点比较，IGF-1R mRNA第14天较第7天有升高，但差异无统计学意义(P=0.547)；第21天较第7天有升高，且差异有统计学意义(P=0.007)；第28天较第21天有下降，但差异无统计学意义(P=0.082)，见表2。

三、两组小鼠肺组织中IGF-1和IGF-1R蛋白表达水平

油酸组小鼠肺组织中IGF-1和IGF-1R蛋白表达水平高于对照组(P=0.000和P=0.000)。油酸组不同时间点比较，IGF-1蛋白表达水平随时间逐步升高(P<0.05)，第21天达到高峰，第28天较第21天有下降，差异有统计学意义(P=0.031)。IGF-1R蛋白表达水平随时间逐步升高(P<0.05)，第21天达到高峰，第28天较第21天有下降，差异有统计学意义(P=0.030)，见表3和图1。

四、两组小鼠肺组织中IGF-1、IGF-1R和胶原Ⅰ/Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白、CD68和增殖细胞核抗原阳性细胞数

油酸组小鼠肺组织中IGF-1和IGF-1阳性细胞数高于对照组(P<0.01)，见表4。油酸组不同时间点比较，IGF-1和IGF-1R阳性细胞数随时间逐步升高，第21天达到高峰，第28天较第21天有下降(P=0.02和P=0.13)。胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白、CD68和增殖细胞核抗原阳性细胞数随时间推移持续升高，至第21天后趋向平缓，见表5。

图1 油酸组小鼠肺组织中IGF-1和IGF-1R蛋白表达水平

表1 油酸组各时段小鼠肺泡炎和肺纤维化程度评分

表2 两组小鼠肺组织中IGF-1mRNA和IGF-1R mRNA表达水平

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01

表3 两组小鼠肺组织中IGF-1和IGF-1R蛋白表达水平

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01

表4 两组小鼠肺组织中IGF-1和IGF-1R阳性细胞数水平

注：与对照组比较，aP<0.01

表5 油酸组小鼠肺组织中IGF-1、IGF-1R和胶原Ⅰ/Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白、CD68和增殖细胞核抗原阳性细胞数

讨 论

IGF-1是一种活性蛋白多肽物质，几乎可作用于所有的组织细胞[9]，其与受体IGF-1R结合后启动胞内信号转导，可促进细胞增殖分化，有效地抑制细胞程序性死亡[10]。IGF-1在肺损伤中也扮演了重要的角色[11-14]。IGF-1被认为是肺泡巨噬细胞衍生的生长因子，刺激细胞进入G1期，促进细胞增殖，抑制细胞的凋亡，与肺纤维化疾病的进展有关[15]。胶原是最主要的细胞外基质蛋白，α-平滑肌肌动蛋白是肌成纤维细胞的标志，CD68是巨噬细胞特异性抗原， 增殖细胞核抗原是细胞增殖状态的最有效的标志之一。本研究结果显示，在相应时间点油酸组小鼠IGF-1和IGF-1RmRNA、阳性细胞数和蛋白的表达趋势一致，组织胶原Ⅰ和胶原Ⅲ，α-平滑肌肌动蛋白，CD68和增殖细胞核抗原亦随损伤时间而升高，其动态变化与组织病理肺纤维化进程一致。提示IGF-1可能通过促进胶原Ⅰ和胶原Ⅲ以及α-平滑肌肌动蛋白，CD68和增殖细胞核抗原的生成，增加肺间质胶原的沉积，加重肌成纤维细胞的增殖，从而促进急性肺损伤小鼠肺纤维化。

肺纤维化的发生与成纤维细胞增殖和细胞外基质增加有关。成纤维细胞增殖与分泌活性的变化是器官纤维化形成的基础，正常情况其下处于静息状态，当受到刺激后即活化并增殖、分化和发生表型转化，转变成肌成纤维细胞，其合成胶原的能力大大增强。前期研究结果显示，血清IGF-1水平随损伤时间而递增，其变化趋势与肺组织病理的纤维化进程一致，提示IGF-1可能参与了 ARDS的发病过程，其动态演变在急性肺损伤发病机制中可能起到了重要的作用[7]。本研究结果显示，油酸诱导小鼠急性肺损伤后，第7～21天肺组织中的IGF-1和IGF-1R mRNA和蛋白的表达明显升高，提示油酸诱导小鼠急性肺损伤可促进IGF-1和IGF-1R的生成。免疫组化结果显示，油酸注入后，第7天小鼠肺组织胶原Ⅰ和胶原Ⅲ，α-平滑肌肌动蛋白，CD68和增殖细胞核抗原增多，并随时间出现表达增强的趋势，与病理切片肺组织纤维化同步变化。提示IGF-1与IGF-1R结合后，可能通过直接刺激成纤维细胞增殖和胶原合成，增强细胞外基质沉积和降低细胞凋亡的方式，促进了急性肺损伤小鼠肺纤维化。Krein等[16]从8例ARDS患者的一系列肺活检组织切片中，通过免疫组化染色，发现在FP-ARDS中IGF-1和IGF-1受体，胶原Ⅰ和胶原Ⅲ，α-平滑肌肌动蛋白，CD68和增殖细胞核抗原升高。临床肺组织标本检测亦表明，IGF-1可能在ARDS肺纤维化的细胞外基质蛋白的沉积和细胞增殖中起作用。李蓓等[17]采用染毒前7 d经气管内滴入携带IGF-1基因的重组腺病毒5载体(Ad5-IGF-1)对吸入全氟异丁烯诱导的急性肺损伤小鼠进行干预，结果显示，急性肺损伤小鼠在肺透明膜的形成，弥漫性肺泡肺不张，肺水肿、红细胞的渗出以及纤维增生方面明显地减轻，提示IGF-1对吸入全氟异丁烯诱导的急性肺损伤小鼠具有保护作用，可以减缓肺纤维化。

本研究初步证实IGF-1促进了油酸诱导急性肺损伤小鼠肺纤维化的形成，下一步我们将利用单克隆抗体阻断IGF-1R，进行细胞增殖、凋亡、迁移的测定，进一步验证IGF-1与ARDS肺纤维化的关系，为发现针对该关键炎症介质的药物研发提供理论基础。同时，IGF-1还能作为一种促进因子增强其它与纤维增生有关的细胞因子如TGF-β1、CTGF、PDGF 等的作用[18-20]，因此，我们还将继续探索IGF-1如何通过旁分泌介导细胞-细胞间作用，从而促进ARDS肺纤维化的发生与发展。

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(本文编辑：王亚南)

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Insulin-like growth factor-1 promotes pulmonary fibrosis with time in acute lung injury induced by oleic acid in a rat model

Liufeng1,Huanghuaping1,Chenmingjing2,Lixi1,Liumeihua1,WangJie1.

1DepartmentofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,RespiratoryDiseaseInstituteofHainanMedicalUniversity,Haikou570102,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570102,China

Huanghuaping,Email:our803@sina.com

Objective To investigate the role of insulin-like growth factor-1 in the development of pulmonary fibrosis in acute lung injury induced by oleic acid in a rat model. Methods The mice were injected with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously to induce ALI. Sixty BALB/c mice were randomly divided into an oleic acid group (n=35) and a control group (n=25). The oleic acid group was treated with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously and the control group was treated with same amount of normal saline. 3 rats in each group respectively were sacrificed on 1st, 3rd, 7 th, 14 th, 21 th and 28 th day after the treatment. The expression levels of IGF-1 and IGF-1R mRNA were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction ( qRT-PCR), the protein levels of IGF-1 and IGF-1R were measure by western blotting assay and the number of positive cells of IGF-1, IGF-1R, collagen Ⅰ, collagenⅢ, α-smooth muscle actin, CD68 and proliferating cell nuclear antigen were measure by immunohistochemical assay, meanwhile, pathological changes were observed in sections of left lung stained with Hematoxylin Eosin and Masson. Results Compared with control group, the expression levels of IGF-1 and IGF-1R mRNA, the protein levels and the number of positive cells of IGF-1 and IGF-1R in lung homogenate of the rats in the oleic acid group were significantly increased with time(P<0. 05). And the number of positive cells of IGF-1, IGF-1R collagen Ⅰ, collagenⅢ, α-smooth muscle actin, CD68 and proliferating cell nuclear antigen synchronously increased with time in the oleic acid group. The phase in early (1-3 d) was characterized by acute alveolitis. The phase in later stage (7-21 d) was characterized by marked proliferation of fibrous tissue. It would become slower after 28 th day. Conclusions The expression of IGF-1, IGF-1R, collagen Ⅰ, collagenⅢ, α-smooth muscle actin, CD68 and proliferating cell nuclear antigen are increased strong with time in lung homogenate in acute lung injury induced by oleic acid in a rat model which are consistent with the progression of pulmonary fibrosis in the comparison of the lung histopathological examination. The study indicated that insulin-like growth factor-1 probably promoted pulmonary fibrosis by up-regulating the expression of collagen Ⅰ, collagenⅢ, α-smooth muscle actin, CD68 and proliferating cell nuclear antigen which could increase pulmonary interstitial collagen deposition and proliferation of myofibroblasts in acute lung injury induced by oleic acid in a rat model.

Oleic acid; Acute lung injury; Pulmonary fibrosis; Insulin-like growth factor-1; Insulin-like growth factor-1 receptor

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.006

海南省自然科学基金课题(811216)

570102 海口，海南医学院第一附属医院呼吸内科·海南医学院呼吸病研究所1

570102 海口，海南医学院第一附属医院病理科2

黄华萍，Email: our803@sina.com

R563

A

2017-03-14)