2008～2013年—2013年上海市售海产品中副溶血性弧菌污染的监测和毒力基因分析小结

田明胜+彭少杰+陈波+厉曙光

摘要： 目的了解上海市市售海产品中副溶血性弧菌的污染水平和特征。方法2008～2013年，采用GB/T 4789.7-2008《食品衛生微生物学检验副溶血性弧菌检验》方法，对上海市批发市场、集贸市场、卖场超市、餐饮环节和网购环节等污染物监测点采集的市售海产品进行副溶血性弧菌污染的定量检测，对副溶血性弧菌食品分离株采用PCR方法对其进行毒力基因耐热直接溶血素（tdh）、耐热直接溶血素相关溶血素（trh）的检测。结果 共监测市售海产品2643件，共在192件样品中检出副溶血性弧菌，总体检出率7.3%；2.6%（5/192）的菌株tdh或trh阳性，tdh和trh的携带率分别为2.1%（4/192）和0.5%（1/192）。不同监测月份、不同食品类别和不同采样地点的海产品，其副溶血性弧菌污染水平总体上存在差异（ P<0.05）。其中6～10月份海产品副溶血性弧菌检出率和样品平均浓度显著高于其他月份（P<0.05）；海产鱼类的副溶血性弧菌检出率（8.4%）和几何平均浓度（0.209 MPN/g） 显著高于其他种类海产品（P<0.05）；批发市场、集贸市场和卖场超市采集海产品副溶血性弧菌浓度显著高于其他场所（ P<0.05）。结论上海市售海产品中副溶血性弧菌在夏秋季节污染较高，部分食品分离株携带有tdh或trh基因，应继续开展海产品中副溶血性弧菌污染的风险监测和探索其环境影响因素，并针对副溶血性弧菌污染的高风险节点开展风险评估和管理。

关键词： 海产品； 副溶血性弧菌； 监测； 毒力基因

Analysis of contamination and virulence genes of Vibrio parahaemolyticusin seafoodsduring 2008～2013 in Shanghai markets

MingshengTiana，b，ShaojiePengb，Bo Chena，ShuguangLia*，

（a Department of Nutrition and Food Hygiene， School of Public Health， Fudan University， 130Dong An Road， Shanghai， China.b General Enforcement Team of Shanghai Food and Drug Administration， 615Liu Zhou Road， Shanghai， China.）

Abstract： ObjectiveTo investigate and characterize the contamination ofVibrio parahaemolyticus in seafoods inShanghai markets.MethodsBased on the method of GB /T 4789. 7-2008 Microbiological Examination of Food

Hygiene：Examination of V.parahaemolyticus，the contamination of V. parahaemolyticus in seafoods from

different predeterminedmonitoring sites in Shanghai was quantitatively determined and the occurrence of virulence genesthermostable direct hemolysin （tdh） and TDH-related hemolysin （trh）， in 192 seafoodssepalatedVibrio parahaemolyticusstrains was detectedby PCR.ResultsA total of 2643 seafoodsamples from wholesale markets，retail markets，supermarkets，catering industries and online shoppingswere collected from January to December in the years of 2008 to 2013.V.parahaemolyticuswas found in 192 samples （ 7.3% ） .Among 192 separated strains， 2.6% （5/192） carry tdh or trh. 2.1%（4/192）were positive for tdh， and 0.5% （1/192） were positive for trh；The geometricmean densities of V. parahaemolyticuswere different significantly in varied seafoodsspecies，sampling monthes，as well aslocations（ P<0. 05） .Especially，geometricmean densitiesof V.parahaemolyticusin June to October were significantly higher than those in othermonths （ P<0. 05） .the detection rate （ 8.4% ） andgeometricmean densities（0.209 MPN/g ） of V.parahaemolyticusin fishes was significantly higher than other seafoods（ P<0. 05 ）. The geometricmean densitiesof V.parahaemolyticus in seafoodsfrom wholesale markets，retail markets，supermarketswere higher than those from other sampling

resources （ P<0. 05）.ConclusionThe contamination ofV.parahaemolyticus inseafoods during summer and fall was relatively high from Shanghai markets .some separated Vibrio parahaemolyticusstrains take virulence genestdh and trh. Thus the contamination of V.parahaemolyticus in seafoodsneeds to be intensively monitored and environmental impact factor should be searched for implementing risk assessment and management on high risk points for Vibrio parahaemolyticuscontamination.

Key words： Seafoods； Vibrio parahaemolyticus；Contaminant Monitoring； Virulence Genes

副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus，以下简称VP） 是一种重要的食源性致病菌，广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物和海产品中，主要引起急性胃肠炎和原发性败血症。国家食源性疾病监测网1992～2001年的数据显示，VP食物中毒居微生物食源性疾病之首，占31.1%，中毒食品主要是海产品[1]；2003～2007 年食源性疾病监测网报告的细菌性食源性疾病暴发资料中，由VP导致的中毒事件数报告数为308起，涉及发病人数8234人，分别占同期细菌性食源性疾病报告起数和人数的29.1%和25.5%[2]；上海2000～2007 年期间报告的集体性食物中毒事件中由VP引起的起数和患者人数分别占同期起数和人数的57.4% 和56.0%[3]。

为了解上海市售海产品中VP的污染水平和毒力基因特征，2008-2013年对上海市售海产品的VP污染情况进行了连续监测。

1 材料与方法

1.1 样品来源

根据本市食品中食源性致病菌污染监测计划，在水产批发市场、集贸市场、卖场超市、餐饮环节和网购环节等固定监测点，按照无菌采样原则采集各类生鲜海产品2643件，样品包括海产鱼类、海产贝类、海产虾类、海产蟹类和海产头足类。采样后样品于2～8℃冷藏条件下保存运输送实验室，采样后3h内进行实验室检验；网购样品于冷链条件下运输至实验室，在样品开箱验视包装完整后即刻进行实验室检验。

1.2 检测方法

采用GB/T 4789.7-2008《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》方法进行VP的定量检测，2008年5月～2010年10月间，3个稀释度的检样量分别为0.1g、0.01g和0.001g，最低检出限<3.0 MPN/g；2011年1月～2013年12月间，3个稀释度的检样量分别为1.0g、0.1g和0.01g，最低检出限<0.3 MPN/g。检测VP阳性菌株在-80℃冷冻保存，在年末集中对本年检测分离的VP菌株进行耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin，tdh）和tdh相关溶血素（TDH-related hemolysin，trh）毒力基因的检测，其中tdh1[4]的引物序列（5～3）为上游：GGTACTAAATGGCTGACATC，下游：CCACTACCACTCTCATATGC；tdh2[5]的引物序列（5～3）为上游：GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC，下游：GGAATAGAACCTTCATCTTCACC；trh1[4]的引物序列（5～3）為上游：GGCTCAAAATGGTTAAGCG，下游：CATTTCCGCTCTCATATGC；trh2[5]的引物序列（5～3）为上游：TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT，下游：CATAACAAACATATGCCCATTTCC。

1.3 统计方法

用Excel 软件进行数据导入，统计分析采用SPSS 18.0。参考文献[6]中m=-（2.303/V）*log（S/n）计算公式，按年月分层后计算未检出样品中VP污染的最可能值，其中S为阴性样品件数，n为测试样品件数，V为取样量。VP浓度经对数转化后符合正态分布，样品VP平均浓度用几何均数表示，不同组间VP平均浓度方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐时采用非参检验的秩和检验。

2 结果

2.1 不同监测年份海产品中VP的污染情况

不同监测年份海产品产品VP浓度总体差异有统计学意义（P<0.05）。6年间VP平均浓度最高的为2009年（3.090 MPN/g），其次为2010年（2.188 MPN/g）和2008年（1.778 MPN/g），2011～2013年间VP平均浓度显著降低，并且其检出率也显著低于2008-2010年。除2011年VP阳性菌株中未发现产毒基因外，其余5年均在其中1株分离株中发现tdh或trh基因，见表1。

2.2 不同监测月份海产品中VP的污染情况

不同监测月份海产品VP浓度总体差异有统计学意义（P<0.05）。VP检出率和VP平均浓度前3位依次为8月份（16.6%，1.023MPN/g）、7月份（14.6%，0.55 MPN/g） 和9月份（8.3%，0.417 MPN/g）。11月～4月海产品VP污染则是偶有检出，其污染水平显著低于5月～10月。tdh或trh基因则主要集中在7月、8月和9月检测发现的VP阳性分离株中，见表2。

2.3各类海产品中VP的污染情况

不同种类海产品VP浓度总体上差异有统计学意义（P<0.05）。各类海产品浓度最高为海产鱼类（0.209 MPN/g），最低为海产蟹类（0.023 MPN/g），海产虾类、海产贝类和海产头足类VP污染平均浓度总体上无差异。tdh或trh基因则主要集中在海产鱼类、海产虾类和海产蟹类的VP阳性分离株中，见表3。

2.4不同采样地点海产品中VP的污染情况

不同采样地点海产品VP浓度总体差异有统计学意义（P<0.05）。其中，批发市场、集贸市场和卖场超市海产品VP检出率和浓度均显著高于其他采样地点相应指标（P<0.05），餐饮环节海产品中VP检出率和浓度均显著低于前述三个环节，而网络环节的22件海产品中未见有VP检出，tdh或trh基因则主要集中在批发市场、集贸市场和餐饮环节，其中餐饮环节有3株VP阳性菌株均检出tdh基因，见表4。

3 讨论

VP污染已成为我国东南沿海省份一个严重的食品安全问题。海产品是VP食源性污染的主要媒介。美国1973～1998 年所有VP食源性暴发的媒介均为海产品或与海产品交叉污染的食品[7]。日本全国调查发现，VP肠炎主要由海产鱼、贝类及其加工产品引起[8]。作为一种食源性致病菌，人群VP食物中毒的发生和食品中VP污染量有关。

近年来，国内已陆续开展海产品中VP的定量监测。刘秀梅等[9]于2003年9～12月对福建、广东、江苏和浙江4省市场上的海产品VP污染进行主动监测，VP总体检出率为38.6%，其中甲壳类、贝类和鱼类检出试样VP浓度分别为171.4、76.9 和50.8MPN/100g。陈艳等[10]于2003年4～8月对福州和厦门市场上的牡蛎进行了VP污染的定量研究，试样VP的检出率为58.4%，平均浓度为60MPN/100 g；彭少杰等[11]于2008～2010年夏秋季节对来自上海市场的海水产品VP污染进行了监测和报道，检出率为13.2%，检出几何均值为2.4 MPN/g。和本研究相比，上述研究相应海产品总体检出率虽然显著高于本研究（7.3%），但VP污染浓度却基本类似或处于同一数量级上，检出率差异可能和样品产地、抽样月份、检验方法、浓度结果的计量单位等不同有关，但本研究是在一个更大的时间跨度（连续6年并且在后面3年具体到每月）内抽样检验的，对于分析海产品中VP污染的季节变异性更有实践意义。

本研究显示，上海地区不同监测点、不同品种和不同月份海产品的VP检出率和VP 浓度均存在差异。其中，批发市场、集贸市场和卖场超市采集海产品VP浓度显著高于其他场所（P<0. 05），这可能与海产品捕捞后储存运输和销售期间是否能始终保持冷藏冷冻状态等因素有关[12]；海产鱼类的VP检出率（8.4%）和样品平均浓度（0.209 MPN/g） 显著高于其他种类的海产品（ P<0. 05），与海产鱼是上海地区主导消费海产品，一年四季均有不同种类销售，而蟹贝类则有明显季节性供应有关；6～10月份海产品VP检出率和样品平均浓度显著高于其他月份（ P<0.05），这既与本市6～10月份常为VP集体性食物中毒高发月份[3]相吻合，也与Depaola等[13]的研究揭示的在海产品产地海域水温超过20℃时VP污染浓度较高结果相一致，提示零售市场上海产品中VP的污染水平既与捕捞海域海水温度的季节性变化有关[14]，又和捕捞后储存运输和销售期间环境温度是否能抑制细菌生长间有较为密切的关系[15]。

上海市售海产品中VP污染较为严重，部分食品分离株携带有tdh或trh基因，若销售和消费环节贮藏温度不当和时间过长则易导致海产品中VP大量繁殖，而居民常有在夏秋季节生食或半生食炝虾、醉虾等海产品的习惯，这可对公众健康构成威胁。监管部门应在夏秋季节加强海产品零售和储存期间海产品冷藏冷冻温度的监管，避免储存温度过高可能导致的VP大量增殖；而餐饮企业则需要在夏秋季节加工海产品时防止交叉污染，以及烹飪时的烧熟煮透；风险监测部门应继续对市售海产品开展连续性的定量监测，探索其环境影响因素，并针对副溶血性弧菌污染的高风险节点开展风险评估、交流和管理。

参考文献

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