基于遗传多样性分析的海洋保护区典型物种保护措施研究——以山东昌邑国家级海洋生态特别保护区柽柳为例

刘国宁，隽云昌，张守本，李秋霞，秦华伟，宋秀凯，马元庆，付新华

(1.潍坊市海洋环境监测中心站 潍坊 261041；2.山东省海洋环境与资源研究院 烟台 264006；3.潍坊医学院 潍坊 261053)



基于遗传多样性分析的海洋保护区典型物种保护措施研究
——以山东昌邑国家级海洋生态特别保护区柽柳为例

刘国宁1，隽云昌1，张守本1，李秋霞1，秦华伟2，宋秀凯2，马元庆2，付新华3

(1.潍坊市海洋环境监测中心站 潍坊 261041；2.山东省海洋环境与资源研究院 烟台 264006；3.潍坊医学院 潍坊 261053)

遗传多样性是评价自然生物资源的重要依据,可为遗传资源保存、育种、遗传改良以及制定物种保护措施等工作提供理论支撑。山东昌邑国家级海洋生态特别保护区是全国唯一的、以柽柳林生态系统为主要保护和管理对象的国家级海洋特别保护区。文章利用ISSR分子标记技术,对30个柽柳个体的遗传多样性进行分析,并根据分析结果提出避免从外区域移栽、控制人类活动和开展遗传多样性研究等保护措施,为深入了解该保护区典型保护物种柽柳的遗传结构、多样性、种质资源以及制定合理有效的生态系统保护策略提供理论依据。

遗传多样性;海洋保护区;柽柳;生态保护；ISSR分子标记

1 引言

生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性3个层次，其中遗传多样性是物种多样性和生态系统多样性的基础，更是评价自然生物资源的重要依据。对于遗传多样性的研究有助于更清楚地认识现有生物资源状况,为采取更为适当的策略保护和合理利用现有资源提供正确的理论指导[1]，从而可为遗传资源保存、育种、遗传改良以及制定物种保护措施等工作提供理论依据[2-4]。随着分子生物学技术的飞速发展，AFLP、SSR、ISSR和SNP等分子标记在遗传多样性研究中被经常使用[5-7]。其中，简单重复序列间扩增(ISSR)不仅操作简便、成本低，而且具有较好的稳定性和多态性，得以广泛应用[8-10]。

柽柳(Tamarixchinensis)为柽柳科、柽柳属[11]，因具有较高的耐盐碱、耐水湿、抗风蚀沙埋等多种生物学特性，现已成为盐碱地土壤改良中非常重要的树种[12]。

山东昌邑国家级海洋生态特别保护区地处渤海莱州湾南岸，总面积2 929 hm2，是全国唯一的以柽柳林生态系统为主要保护和管理对象的国家级海洋特别保护区。该保护区内天然柽柳林面积大、分布集中、生态景观奇特、地理位置特殊，在我国北方沿海实属罕见。作为柽柳的自然基因宝库，该保护区的柽柳居群在该区域自身生态系统维护与资源种质保护上均具有重要价值。

文章利用ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子标记技术，对30个柽柳个体的遗传多样性进行分析，并根据分析结果提出相应保护措施，为深入了解山东昌邑国家级海洋生态特别保护区典型保护物种柽柳的遗传结构、多样性、种质资源以及制定合理有效的生态系统保护策略提供理论依据。

2 材料与方法

在山东昌邑国家级海洋生态特别保护区内均匀布设30个站位。以采集柽柳叶为主，质量在50 g以上，放入双层聚乙烯袋中，带回实验室冰冻保存(-10℃～-20℃)。

将柽柳叶剪碎、液氮研磨，采用Omega公司的植物组织DNA提取试剂盒提取柽柳基因组，利用GoldviewⅠ作核酸染料的1%的琼脂糖凝胶电泳检测，其中以1×TBE作为缓冲液，以87 V的电压电泳30 min后，凝胶成像系统分析DNA提取结果，符合实验需求的DNA提取物放于-20℃冰冻保存待用。

3 遗传多样性的ISSR分析

3.1 ISSR-PCR引物筛选

在哥伦比亚大学公布的100条引物中选取52条引物合成，随机选取2个样本为模板进行ISSR-PCR反应，PCR反应体系和条件参考文献[13]。进行优化后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，凝胶成像系统分析以筛选用于分析的适当引物。适当引物其扩增产物应条带清晰，且对所有样本均有质量好的多态性条带。

3.2 ISSR-PCR扩增

分别以30个柽柳样本提取好的基因组DNA为模板,以筛选后的ISSR引物进行PCR扩增。其PCR反应体系(20 μL)及条件经条件优化后为：1 μLDNA模板、1 μL引物、10 μL DreamTap Green PCR Master Mix(2×)、8 μLddH2O。PCR反应程序为：95℃，5 min预变性；95℃、30 s变性,50℃、30 s退火，72℃、45 s延伸的35个循环；72℃，10 min延伸；4℃结束。PCR产物再经过琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照,以待统计分析。

3.3 结果统计与数据分析

根据琼脂糖凝胶电泳图谱，人工直接判读每个个体的等位基因,扩增条带用“1”和“0”表示有或无，建立数据库。利用Popgene 1.32软件计算群体内相关遗传系数[14]，主要包括遗传多样性系数(观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数、Shannon’s表型多样性指数)和多态性位点百分比。

根据核苷酸条带将数据录入Popgene 1.32中，作为二倍体数据进行处理，计算群体内相关遗传系数，主要包括遗传多样性系数(观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数、Shannon’s表型多样性指数)、多态性位点百分比和Ewens-Watterson中性检验(即根据等位基因变异频率的偏倚检测群体是否偏离中性进化)。

采用NTSYSpc-2.10对编辑好的数据进行处理，计算所有个体之间的遗传距离矩阵、遗传相似性并绘制聚类图[15]。

根据NTSYSpc-2.10计算的遗传距离矩阵，将该矩阵转换为.meg格式，再使用MEGA 6.06进行处理，计算该群体内的平均遗传距离并绘制系统发育树。

4 结果与分析

4.1 引物筛选

从哥伦比亚大学公布的100条引物中筛选出利于分析的12条引物，以进行ISSR-PCR体系扩增分析(表1)。

表1 用于基因组DNA序列ISSR-PCR反应的引物序列

续表

4.2 ISSR-PCR反应结果

筛选出来的12条引物分别PCR扩增30个样本，经电泳检测可见每个DNA模板下对应一至多个条带，且条带的亮度呈现差异性(图1)。

图1 柽柳引物ISSR扩增

在琼脂糖凝胶电泳图谱中，各模板对应一至多个条带。在同一模板中，条带的位置不同体现扩增出的DNA长度的差异，条带的条数不同体现基因组模板具有多个结合位点；在不同模板中，存在条带条数、位置、图上带亮度等的差异，体现各样本与引物结合位点、结合力等的差异，即表现柽柳各样本的遗传多样性。

4.3 ISSR多样性系数

山东昌邑国家级海洋生态特别保护区的30个柽柳样本，观测等位基因数(Na)为1.810 8、有效等位基因数(Ne)为1.310 1、Nei’s基因多样性指数(He)为 0.194 8、Shannon’s表型多样性指数(I)为0.313 8、多态性位点百分比(PPB)为81.08%、平均遗传距离为0.182 043 93，柽柳的系统发育树如图2所示。结果表明，柽柳的遗传多样性较高、个体间的遗传距离较大。

图2 柽柳聚类

5 结论与建议

山东昌邑国家级海洋生态特别保护区内的柽柳具有相对丰富的遗传多样性，Shannon’s表型多样性指数(I)为0.313 8、多态性位点百分比(PPB)为81.08%。柽柳具有多年生习性和复杂交配体系，兼性异交，但缺乏自花传粉机制，只能通过蝇和蜜蜂等传粉媒介授粉[16]，其个体间的异交机会随之增加，因而提高该物种遗传多样性的丰度，这可能是保护区内柽柳遗传多样性稳定的主要原因。建议继续加大对柽柳保护区的保护力度，避免从外区域移栽，保护柽柳的分布范围和数量，防止遗传多样性指数降低。

山东昌邑国家级海洋生态特别保护区内人口密度小，人为活动对柽柳居群遗传多样性的影响较小，此外保护区对柽柳资源的保护力度较大，从而使该区柽柳遗传多样性得以维持较高水平。建议继续控制人类在保护区内的活动，避免过度开发，保持遗传多样性的稳定。

山东昌邑国家级海洋生态特别保护区内柽柳的遗传多样性指数比黄河三角洲小[13]，其原因可能是黄河三角洲柽柳居群研究样品量较大，而居群变小会导致遗传多样性指数降低[17]。建议扩大保护区柽柳样本量，继续开展柽柳遗传多样性研究，在遗传多样性分析的基础上尽快制定保护区发展规划，合理移栽区内柽柳，加大柽柳居群，提高柽柳遗传多样性指数，将保护区建成管理先进、体系完善、机制创新、功能齐全的海洋生态特别保护区。

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Protection Measures for Typical Species in Marine Protected Areas Based on the Analysis of Genetic Diversity:TakeTamarixchinensisin Shandong Nearby National Special Marine Reserve as an Example

LIU Guoning1，JUAN Yunchang1，ZHANG Shouben1，LI Qiuxia1，QIN Huawei2，SONG Xiukai2，MA Yuanqing2，FU Xinhua3

(1.Weifang Marine Environment Monitoring Centre，Weifang 261041，China;2.Shandong Marine Resource and Enviroment Research Institute，Yantai 264006，China;3.Weifang Medical University，Weifang 261053，China)

Genetic diversity is the important basis for evaluation of natural biological resources，which can provide theory support for conservation,breeding and genetic improvement of genetic resources,as well as making protection measures to protected species.Shandong nearby national marine ecological special reserve is the only national marine protected areas taking tamarix as the main object of protection and management.The genetic diversity of 30 tamarix samples were analyzed by using ISSR molecular markers,to understand the genetic structure,diversity,germplasm resources and corresponding protection measures of avoiding transplanting from outside areas,controling human activities and carrying out genetic diversity research,according to the results.It also will provide theoretical basis to formulate rational and effective ecosystem protection strategies.

Genetic diversity，Marine protected areas，Tamarixchinensis，Ecological protection,ISSR molecular markers

2016-12-19；

2017-05-22

山东省渤海海洋生态修复及能力建设项目(20140601)；潍坊市科学发展计划项目(2016ZJ1047).

刘国宁，工程师，研究方向为海洋环境监测，电子信箱：hjk@wfhy.ac.cn

付新华，副教授，博士，研究方向为生物化学与分子生物学，电子信箱：wfyxyfxh@163.com

P74

A

1005-9857(2017)06-0046-05