HHIP基因多态性与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系研究

成芳娟，关 键，任 侠，马程远

·论著·

HHIP基因多态性与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系研究

成芳娟，关 键*，任 侠，马程远

目的 探讨HHIP基因rs13118928、rs1828591位点单核苷酸多态性(SNPs)与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性的关系。方法 选取2014年10月—2016年5月在伊犁州友谊医院、新华医院、石河子大学医学院第一附属医院呼吸科住院及门诊就诊的COPD患者214例为病例组。另选取同期在这几家医院进行体检的健康者350例为对照组。统一使用美国Medgraphics公司的肺功能仪进行用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气末容积(FEV1)测定，并记录FEV1占预计值百分比、FEV1/FVC。所有受试者抽取外周静脉血标本，提取标本DNA，运用imLDRTM多重SNP分型技术检测HHIP基因各位点的多态性。结果 两组rs13118928位点基因型及等位基因分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。两组rs1828591位点基因型及等位基因分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组rs13118928位点不同基因型患者FEV1占预计值百分比、FEV1/FVC比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组rs1828591位点不同基因型患者FEV1占预计值百分比、FEV1/FVC比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。两组HHIP基因rs13118928、rs1828591两位点单体型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HHIP基因rs13118928、rs1828591位点SNPs与新疆哈萨克族COPD易感性无明显关系。

肺疾病,慢性阻塞性；HHIP基因；多态性,单核苷酸

成芳娟，关键，任侠，等.HHIP基因多态性与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系研究[J].中国全科医学，2017，20(19)：2378-2382.[www.chinagp.net]

CHENG F J,GUAN J,REN X,et al.Relationship between HHIP gene polymorphism and chronic obstructive pulmonary disease susceptibility in Kazakh population in Xinjiang,China[J].Chinese General Practice，2017，20(19)：2378-2382.

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的以持续性气流受限为特征且气流受限呈进行性发展的复杂性疾病。目前COPD的发病机制尚不完全明了，可能与吸烟及遗传等因素有关。一项全基因组关联研究(GWAS)荟萃分析研究了20 890例欧洲人的外周血等位基因型，发现包括HHIP在内的8个基因和第1秒用力呼气末容积(FEV1)与用力肺活量(FVC)比值有关[1]。一项对挪威823例COPD患者及 810 例吸烟者的对照分析发现，HHIP基因与FEV1/FVC相关，可能是COPD重要风险基因[2]。本研究旨在探讨中国新疆地区哈萨克族HHIP基因 rs13118928、rs1828591位点与COPD的易感性的关系，以期从分子水平探究基因遗传对新疆地区哈萨克族COPD病程进展的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年10月—2016年5月在伊犁州友谊医院、新华医院、石河子大学医学院第一附属医院呼吸科住院及门诊就诊的COPD患者214例为病例组。诊断标准：均符合2015年COPD诊断、治疗和预防的全球战略中的诊断标准[3]，即凡具有吸烟史和/或环境职业污染及生物燃料接触史，临床上有呼吸困难或咳嗽、咳痰病史，进行肺功能检查，吸入支气管扩张剂后FEV1/FVC<70%，可确诊为 COPD。排除标准：支气管哮喘、支气管扩张等其他肺部疾病和胸部手术病史。另选取同期在这几家医院进行体检的健康者350例为对照组。本研究经石河子大学第一附属医院伦理委员会批准，受试者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集 记录受试者的性别、年龄，测量身高、体质量，询问吸烟情况。

1.2.2 肺功能检测 统一使用美国Medgraphics公司的肺功能仪进行测定，具体步骤如下：(1)将受试者年龄、性别、身高、体质量输入自行编制的软件(参考值公式参考穆魁津等[4]主编的全国肺功能正常值汇编)，得到受试者肺功能值；(2)受试者取立位，试验前休息5 min，由操作人员说明此项检查的做法，并做示范动作；(3)带鼻夹，通过一次性口器与肺功能仪连接，嘱患者于用力吸气至最大肺容量，然后用力呼出至功能残气位，呼气时间不得少于4 s；(4)重复3次，选取FVC和FEV1之和最大的1次记录结果；(5)通过肺功能检查仪记录FVC、FEV1、FEV1占预计值百分比、FEV1/FVC；(6)若受试者FEV1/FVC<70%，行支气管舒张试验，步骤如下：①患者休息30 min，进行首次肺功能检测；②吸入沙丁胺醇4喷(400 μg)；③休息15 min后再次行肺功能检查，步骤同上；④计算FEV1改善的绝对值和改善率。所有操作人员经过统一培训。

本文要点：

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制尚不完全明确，相关基因研究表明HHIP基因与第1秒用力呼气末容积与用力肺活量比值(FEV1/FVC)有关，可能是COPD的重要风险基因。国内外多项研究结果显示，HHIP基因单核苷酸多态性(SNPs)与COPD易感性及其肺功能相关，但关联的SNPs不尽相同，且同一位点与不同人群COPD 的关系也未达成统一。本研究探讨了中国新疆地区哈萨克族HHIP基因rs13118928、rs1828591位点与COPD易感性的关系，结果未发现HHIP基因rs13118928、rs1828591位点多态性及单体型与 COPD有关，接下来将进一步完善HHIP基因其他位点与哈萨克族COPD易感性的研究并构建其完善的基因体系。

1.2.3 DNA的提取 抽取所有受试者的外周静脉血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用北京 TIANGEN 生化科技公司提供的离心柱型试剂盒提取血液基因组DNA，并于-80 ℃冰箱储存备用，运用超微量分光光度计对DNA纯度及浓度进行检测。

1.2.4 rs13118928、rs1828591位点多态性的测试 采用imLDRTM多重SNP分型技术进行rs13118928、rs1828591位点多态性检测。

1.2.4.1 DNA样本质控 DNA样本取1 μl 1%琼脂糖凝胶电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5～10 ng/μl。

1.2.4.2 多重PCR反应 (1)引物设计：rs13118928位点引物序列为：F:5′ -TTTCTGAGCAGGGAGGGCATCT -3′；R:5′-GGAATTTCTCACAGTGCACACAGG -3′；rs1828591位点引物序列为：F:5′-CTGTGCGTCATTCTTCCCATGT-3′；R:5′-CCCCCAAATTCATGCCTTTTTC -3′。(2)反应条件：反应体系(10 μl)包含1x GC-I buffer(Takara.),3.0 mM镁离子(Mg2+),0.3 mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 样本DNA和1 μl多重PCR引物。(3)PCR 循环程序：首先95 ℃ 2 min，然后循环11次以下过程，94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，每次循环降低 0.5 ℃，72 ℃ 1.5 min；最后 94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循环 24 次；72 ℃ 2 min，在 4 ℃条件下保存。取扩增产物 1.5 μl制胶后进行电泳检测，若有目的片段则验证扩增成功。

1.2.4.3 多重PCR产物纯化 在10 μl PCR产物中加入5 U 虾碱酶(SAP酶)和 2 U 外切核酸酶(Exonuclease I酶)，37 ℃温浴1 h,然后75 ℃灭活15 min。

1.2.4.4 连接反应 (1)反应引物：rs13118928位点，RA:5′-TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTTGCACTTTGGAACCAACTGAATCAT-3′；RG:5′-TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTTGCACTTTGGAACCAACTGAATCAC-3′；RP:5′-AGACAATCAATGTGGAATATTGTTTCTGT-3′；rs1828591位点，FA:5′-TACGGTTATTCGGGCTCCTGTGGGTAATCCAGTGGAGAAGTAAAAGGAA-3′；FG:5′-TTCCGCGTTCGGACTGATATGGGTAATCCAGTGGAGAAGTAAAAGAAG-3′；FP:5′-GATGGAATGGAAGAGAC TATGAAAAAGG-3′。(2)反应体系：10×连接缓冲液 1 μl、高温连接酶 0.25 μl、5′连接引物混合液(1 μM)0.4 μl，3′连接引物混合液(2 μM)0.4 μl、纯化后多重PCR产物 2 μl、双蒸水(ddH2O)6 μl 混匀。(3)反应程序：循环38次以下过程，94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min；4 ℃永久保存。

1.2.4.5 连接产物上ABI3730XL测序仪 取0.5 μl 稀释后的连接产物，与0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD，9 μl Hi-Di混匀，95 ℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪。运用GeneMapper 4.1(Appliedbiosystems)软件对本试验结果进行分析。

2 结果

2.1 两组基本资料比较 两组性别、年龄、每日吸烟量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；两组FEV1占预计值百分比、FEV1/FVC比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 遗传平衡相关度检验rs13118928、rs1828591位点SNP分型结果显示，病例组214个样本，rs13118928位点一个样本分型失败，rs1828591位点全部分型成功；对照组350个样本，两位点全部分型成功。病例组和对照组中HHIP基因rs13118928位点(χ2值分别为0.479、0.494，P值分别为1.000、0.456)、rs1828591位点(χ2值分别为0.472、0.493，P值分别为1.000、0.394)均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。

2.3 两组rs13118928、rs1828591位点基因型及等位基因分布比较 两组rs13118928位点基因型及等位基因分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。两组rs1828591位点基因型及等位基因分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表3)。

表1 两组基本资料比较

Table1Baselinecharacteristicsofthecontrolgroupcomparedwiththoseofthecasegroup

组别例数男/女年龄(x±s,岁)每日吸烟量(x±s,支/d)FEV1占预计值百分比(x±s,%)FEV1/FVC(x±s,%)对照组350293/5760.6±10.519.2±11.288.1±9.886.3±6.7病例组214189/2561.1±10.920.6±12.056.6±10.859.1±5.4t(χ2)值2.265a0.5570.69219.95019.389P值0.1320.5780.490<0.001<0.001

注：a为χ2值；FEV1=第1秒用力呼气末容积，FVC=用力肺活量

表2 两组rs13118928位点基因型及等位基因分布比较〔n(%)〕

注：- 代表以AA为参照

表3 两组rs1828591位点基因型及等位基因分布比较〔n(%)〕

注：- 代表以AA为参照

2.4 病例组rs13118928、rs1828591位点不同基因型患者肺功能指标比较 病例组rs13118928位点不同基因型患者FEV1占预计值百分比、FEV1/FVC比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表4)。病例组rs1828591位点不同基因型患者FEV1占预计值百分比、FEV1/FVC比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表5)。

2.5 两组HHIP基因两位点单体型分布比较 使用Phase软件对HHIP基因rs13118928、rs1828591位点单体型进行推断，共2种单体型形成，即Hap1(AA)、Hap2(GG)，两组HHIP基因两位点单体型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表6)。

Table 4 FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio between patients in the case group by rs13118928 genotypes

基因型例数FEV1占预计值百分比FEV1/FVCAA 58 54.6±9.858.6±5.8GA10657.8±10.959.4±5.5GG 49 56.3±11.858.9±4.9F值1.6920.413P值0.1720.710

Table 5 FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio between patients in the case group by rs1828591 genotypes

基因型例数FEV1占预计值百分比FEV1/FVCAA 60 54.5±9.758.6±5.7GA10657.8±10.959.4±5.5GG 48 56.5±11.858.9±4.9F值1.8100.392P值0.1530.720

3 讨论

HHIP是一种细胞膜蛋白可直接结合音猬因子(SHH)、印度刺猬(Ihh)和沙漠刺猬(DHH)3种配体，这些配体通过结合膜受体PTCH1从而启动刺猬信号通路。HHIP通过与PTCH1竞争刺猬配体的结合，负向调节刺猬蛋白通路，是肺等器官发展的一个重要途径[5-7]。Hh信号通路的活化在一些成体组织的修复、再生过程中发挥着重要的作用[8]。而反复气道炎症所致的气管壁损伤-修复，进而引起气管结构重塑、管腔狭窄、气流受限是COPD 的主要病理基础。尽管COPD的GWAS提供了位于染色体4q31的HHIP基因与COPD 易感性令人信服的证据[9-10]，但其在COPD 发病中的作用机制尚不明确。

表6 两组HHIP基因2位点单体型分布比较〔n(%)〕

Table 6 Patterns of haplotype frequencies for rs13118928 and rs1828591 at the HHIP locus in the case group and control group

组别Hap1Hap2对照组346(49.4)353(50.4)病例组222(52.1)202(47.4)χ2值0.8630.863P值0.3520.352OR(95%CI)1.121(0.881,1.427)0.892(0.701,1.135)

一项GWAS研究表明,HHIP基因附近的单核苷酸多态性 (SNPs)rs1828591、rs13118928 与COPD的风险有关，验证了HHIP基因附近的遗传变异与COPD易感性的关系。两个SNPs与COPD的风险明显相关，其中G等位基因纯合性导致COPD降低40%，并进一步说明了 rs13118928和rs1828591与COPD、肺功能明显有关[9，11]。于2011年ZHOU等[12]在波兰高加索研究人口中，确认了rs13118928 SNPs在同样的基因组区域与重度及极重度的COPD相关联，而且与中度COPD相比可能受到遗传因素很大的影响。2013年KIM等[13]对韩国139例COPD和199例吸烟健康者的研究发现HHIP附近两个SNPs (rs11938704和rs10013495)与COPD的FEV1明显相关，同时在KOLD队列研究中显示该SNPs与COPD的易感性无明显相关，但与其使用支气管舒张剂前后的FEV1明显相关[13]。随后 WANG等[14]调查了中国汉族人群中HHIP多态性与COPD易感性和COPD 相关表型的关系，发现rs12504628与FEV1/FVC相关，rs10519717与COPD的严重程度有关。但未发现SNP rs13118928、rs1828592两位点与汉族COPD 易感性有明显相关。国内外多项群体HHIP基因SNPs关联研究(非亚洲人、韩国人、中国汉族人等群体的各项研究)均显示HHIP基因SNPs多态性与COPD易感性及其肺功能相关，但关联的SNPs不尽相同，且同一位点与不同人群COPD 的关系也未达成统一[9,11-14]。

目前关于HHIP基因多态性与新疆哈萨克族COPD易感性关系的研究尚罕见报道。本研究对新疆哈萨克族COPD与HHIP基因rs13118928、rs1828591位点间的关系进行探讨，未发现HHIP基因rs13118928、rs1828591位点多态性及单体型与 COPD有关。HHIP基因单核苷酸位点较多，在不同地域、种族的人群与COPD相关的SNP不尽相同。此次研究只分析了其中两个位点，新疆哈萨克族人群COPD与其他位点的关系尚不清楚。HHIP基因不同位点间存在连锁不平衡，且COPD 的发病机制较为复杂，因此其在COPD 发病中起关键作用的位点不易确定，需进一步完善HHIP基因其他位点与哈萨克族COPD易感性的研究并构建其完善的基因体系。

作者贡献：成芳娟进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、数据收集与整理、统计学处理、结果的分析与解释、撰写论文、中英文修订；关键进行研究的实施与可行性分析、中英文修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理；任侠进行研究的实施与可行性分析、进行数据收集与整理、统计学处理；马程远进行数据收集。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔沙沙)

Relationship between HHIP Gene Polymorphism and Chronic Obstructive Pulmonary Disease Susceptibility in Kazakh Population in Xinjiang,China

CHENGFang-juan,GUANJian*,RENXia,MACheng-yuan

No.2DepartmentofRespiratoryMedicine，theFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege，ShiheziUniversity，Shihezi832008，China

*Correspondingauthor:GUANJian,Chiefphysician，Professor，Mastersupervisor;E-mail:guanjian6@163.com

Objective To explore the relationship of two single nucleotide polymorphisms(SNPs),rs13118928 and rs1828591,of HHIP gene with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) susceptibility in Kazakh population in Xinjiang,China.Methods The participants enrolled were 214 inpatients and outpatients(case group) who

treatment of department of respiratory medicine,and 350 healthy controls(control group) underwent physical examination,in Ili Kazak Autonomous Prefecture Friendship Hospital,Xinhua Hospital,and the First Affiliated Hospital of the Medical College，Shihezi University from October 2014 to May 2016.Pulmonary function measurement apparatus produced by an American company,Medgraphics Corp.was used to measure the forced vital capacity(FVC),forced expiratory volume in one second (FEV1),FEV1% predicted,and FEV1/FVC ratio.The imLDRTMtechnique for SNP genotyping was used to detect the polymorphisms of HHIP gene in peripheral venous blood cells.Results The patterns of genotype and allele frequencies of rs13118928 at the HHIP locus did not differ significantly between the groups(P>0.05).The patterns of genotype and allele frequencies of rs1828591 at the HHIP locus in the case group were not obviously different from those of in the control group(P>0.05).FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio did not differ substantially between the patients in the case group by rs13118928 genotypes(P>0.05).No differences in FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio were found between the patients in the case group by rs1828591 genotypes(P>0.05).The groups did not display notable differences in the patterns of haplotype frequencies for rs13118928 and rs1828591 at the HHIP locus(P>0.05).Conclusion The two SNPs (rs13118928 and rs1828591) at the HHIP gene locus have no significant correlation with COPD susceptibility in Kazakh population in Xinjiang,China.

Pulmonary disease,chronic obstructive;HHIP gene;Polymorphism,single nucleotide

国家自然科学基金资助项目(81560009)

R 563

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.19.016

2017-02-12；

2017-05-10)

832008新疆维吾尔自治区石河子市，石河子大学医学院第一附属医院呼吸二科

*通信作者：关键，主任医师，教授，硕士生导师；E-mail：guanjian6@163.com