铁皮石斛不同外植体组培快繁技术比较

饶宝蓉 陈泳和 江文清 刘忠辉 梁彦 陈琦辉

摘要 [目的]筛选适宜铁皮石斛繁殖的最佳方法。[方法]以铁皮石斛成熟蒴果和1年生植株茎段作为外植体，研究 MS培养基中添加不同浓度激素对铁皮石斛种子和茎段诱导、增殖以及生根的影响，同时比较了传统玻璃兰花瓶与聚丙烯透明薄膜袋在铁皮石斛工厂化生产上的成本投入。[结果]适合铁皮石斛诱导的培养基为 MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶；适合增殖的培养基为 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶；适合生根的培养基为1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶。对于工厂化生产而言，选用蒴果作为外植体具有利于无菌体系建立、增殖倍数多和苗长势整齐一致等优点，聚丙烯透明薄膜袋可以代替传统的玻璃兰花瓶。[结论]该研究可为减少铁皮石斛组培苗的生产成本、缩短生长周期、获得大量优质组培苗提供一定的理论依据。

关键词 铁皮石斛； 组织培养； 激素；种子；茎段；聚丙烯透明薄膜袋

中图分类号 S503.53 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0138-04

Comparison of Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques of Different Explants in Dendrobium officinale

RAO Bao-rong1，2， CHEN Yong-he1，2*， JIANG Wen-qing2 et al

（1.Nanping Huake Biotechnology Co.， Ltd.， Jianyang，Fujian 354200；2.Nanping Institute of Agricultural Sciences，Jianyang，Fujian 354200）

Abstract [Objective]To select the best method for propagation of Dendrobium officinale.[Method]This experiment used mature capsule and annual stem segments of D.officinale as explants. The paper studied the effects of MS medium supplemented with different concentration hormones on induction， multiplication and rooting of seeds and stem segment. The paper also compared the cost of traditional vase and transparent polypropylene film bags on factory production. [Result]The appropriate medium for the induction of D. officinale was MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L banana+35 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan， the appropriate medium for the proliferation was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L banana+35 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan， the appropriate medium for rooting was 1/2MS+0.80 mg/LNAA+120 g/L banana+20 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan. The paper also showed that using capsule as explants was in favor of establishing the sterile system， multiplication times and consistent seedlings. Transparent polypropylene film bags can replace traditional vase.[Conclusion] The study provides certain theoretical basis for reducing production cost of D. officinale tissue culture seedling， shortening the growth period and getting a lot of high-quality tissue culture seedling.

Key words Dendrobium officinale；Tissue culture；Hormones；Seeds；Stem segments；Transparent polypropylene film bags

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又称黑节草，是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物，含有多糖、生物碱、氨基酸、菲类化合物等大量有益于人体健康的药用活性成分，具有抗肿瘤、抗凝血、降血脂、降血压、提高免疫力、抗衰老等功效[1-2]，是一种名贵珍稀中药材，在《神农本草经》和《本草纲目》 中均被列为上品，被誉为“中华九大仙草之首”，被录入2015版《药典》。其主要分布于我国的浙江、云南、广东、广西、福建、湖南等省（区）以及澳大利亚、东南亚等国家（地区）。

铁皮石斛对生长条件要求十分苛刻，自然产量极为稀少，加上长期过度采挖，造成野生资源濒临灭绝，而利用组织培养技术可以有效扩大铁皮石斛的种植规模[3]。虽然目前关于铁皮石斛的组织培养研究已经有相关报道，但是铁皮石斛试管苗生长周期长、生长整齐度不一、组织培养所需的成本过高等问题是制约其产业化和规模化生产的瓶颈。笔者采取不同外植体，对不同阶段的培养基配方进行筛选，同时对不同接种容器的生产技术及其工艺进行研究，探讨组培快繁过程中不同因素对铁皮石斛生长发育的影响，以期获得适宜的组培快繁条件，为减少组培苗生产成本、缩短生长周期、获得大量优质的组培苗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2014 年在南平市华科生物科技有限公司进行。试验材料为铁皮石斛成熟蒴果、1年生铁皮石斛植株茎段、不透水耐高温高压的聚丙烯透明薄膜袋与普通螺口玻璃兰花瓶。

1.2 方法

1.2.1 无菌系建立。取铁皮石斛成熟蒴果，在流水下冲洗60 min，用洗衣粉液浸泡20 min，继续用流水冲洗干净，在超净工作台上用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3次，放在无菌瓶中用0.1%的HgCl2消毒8 min后，无菌水冲洗6次，滤纸吸干外表水分，放入无菌盘子上用刀片将其剥开，将种子播在无菌诱导培养基表面。约10 d后，看到原来的黄色粉末状种子未被感染且开始转为绿色小原球茎，即以播种方式建立无菌系（图1）。

从1年生铁皮石斛植株上选择生长健壮的茎段，摘去叶片和膜质叶鞘，在流水下冲洗60 min，用洗衣粉液浸泡20 min，继续用流水冲洗干净，在超净工作台上用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3次，放在无菌瓶中用0.1%的HgCl2消毒10 min后，再用无菌水冲洗6次，滤纸吸干水分，放入无菌盘子上，剪去头尾两端0.2 mm后，再剪成约1.0 cm长、带节的小段，插入备好的无菌诱导培养基中，每瓶培养基插4～6个节。约7 d后发现，茎节未被杀死，节上有凸起，培养基表面无感染，即以茎段为外植体的无菌系建立（图2）。

1.2.2 培养基设计。

以MS为基本培养基，在铁皮石斛茎段丛生芽的诱导增殖基本培养基研究中，张书萍等均认为MS培养基优于供试的其他培养基[4-5]。根据试验目的，如诱导（表1）、增殖（表2）、生根（表3）等添加不同浓度的 6-BA

（6-苄基腺嘌呤）[6]，NAA（萘乙酸）[7]和有机添加物，附加蔗糖35 g/L（生根培养基中为20 g/L）、卡拉胶 7.0 g/L，pH 5.8（用1 mol/L NaOH或HCl调节pH）。灭菌条件：121 ℃、131 kPa灭菌20 min。培养基制备好后，置于无菌操作室中，放置72 h，打开紫外灯对无菌操作室进行灭菌。

1.2.3 容器成本比较。

在传统玻璃兰花瓶和不透水耐高温高压的聚丙烯透明薄膜袋内装入等比例生根培养基，增殖苗高约2 cm，单株接入2种容器的培养基中，瓶苗每瓶18株，袋苗每袋14株。重复3次，定期观察记录，90 d时进行生长势对比及成本比较，总成本=（容器成本+培养基成本+清洗容器成本）×（1+污染率）。

1.2.4 培养条件。

材料接种后，在1 800 lx 光照下培养，光照时间11 h/d，温度（25±1） ℃。

2 结果与分析

2.1 不同外植体诱导培养及无菌系建立情况比较

从表4可以看出，試验所设计使用的培养基都能将种子及茎段外植体诱导出芽，诱导率在80%以上，其中以添加1.0 mg/L 6-BA，120 g/L香蕉的组合为好。各培养基中种子诱导出无菌苗的时间为20～35 d，而茎段诱导出无菌苗的时间为8～15 d；种子诱导率为80%～92%，茎段诱导率为86%～94%。2种外植体的诱导发生途径不同，种子外植体需经过种子胚萌发—愈伤组织诱导—原球茎诱导—原球茎分化—发芽等过程，而茎段外植体自植入培养基中10 d后，其茎节部芽体就出现凸起，并产生丛生芽簇，生长较快，芽体粗壮，30 d后能生成健壮完整的芽体，不需要经历原球茎诱导阶段[8]。单从少量成苗的生长周期及保持性状方面来看，茎段外植体培养的时间短，茎段外植体优于种子外植体。但是从无菌系建立效率而言，种子外植体明显优于茎段外植体，种子诱导感染率8%～13%，而茎段诱导感染率为48%～62%。从生长整齐度来看，也是种子外植体优于茎段外植体。铁皮石斛诱导培养基以MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶较好。

2.2 不同外植体建立的繁育体系增殖培养情况比较

以茎段为外植体的繁育途径相对简单，即茎段—丛生芽—完整植株3个阶段，成苗周期短，平均增殖系数小，仅1.2～3.7，短期代数就可以直接用于生根，但是苗生长不整齐，从节上或基部陆续冒出小芽，生长不一（图3）。而种子前期诱导较慢，一旦进入原球茎开始分化阶段，发芽后增殖系数较大，为5.3～7.8，叶浓绿，苗木生长整齐（图4），经过几代的转接瓶内苗数量减少，苗逐渐变壮。从工厂化生产上看，种子繁育可在一定时间内获得大量的成苗。在增殖培养基中添加适量的香蕉效果好，增殖系数高，无菌苗生长正常，不出现茎粗短、玻璃化、黄化及水渍状等情况，茎节间长而粗壮。试验结果表明，香蕉的添加量以120 g/L为宜。综合各因素可知，种子繁育可为铁皮石斛工厂化生产提供更好的基础。从表5可以看出，在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶培养基中进行铁皮石斛增殖培养较为适宜。

2.3 生根培养情况比较

NAA浓度在一定程度上影响着组培苗的生根时间、根系数量和瓶苗生长情况等。从表6可以看出，根的生长势随着NAA浓度的增加而逐渐递增，平均生根系数为1.25～4.12，生根率也逐渐递增。该试验结果表明，在1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶培养基中进行生根培养较为适宜。

2.4 接种容器的成本比较 由图5、6和表7可知，铁皮石斛在兰花瓶内与在聚丙烯透明薄膜袋内的长势没有明显差异，生长周期也没有显著性差异。虽然聚丙烯透明薄膜袋中铁皮石斛苗的感染率高于传统兰花瓶，但是总成本只是传统兰花瓶中的1/2（表8）。主要体现在一次性聚丙烯透明薄膜袋的成本较玻璃瓶成本低，而且采用一次性聚丙烯透明薄膜袋可节省人工成本等。采用一次性聚丙烯透明薄膜袋

对后期的出苗也十分有利，兰花瓶出苗需用镊子将苗从窄口瓶取出，这对苗的根、茎、叶都有一定量的损伤，且容易污染，而一次性聚丙烯透明薄膜袋育苗时只要将袋口完全剪开就可以保持完好的植株，有效提高了后期移栽的成活率。

3 结论与讨论

试验初步建立了一套较完整的铁皮石斛组培快繁体系。组织培养获得铁皮石斛再生植株的途径有很多种，用成熟的蒴果消毒后进行无菌播种形成原球茎，并经过增殖分化发育成完整植株是其中一种，也可以选择适宜的外植体（茎段、茎尖、幼芽、叶片等）诱导形成拟原球茎或者丛生芽来实现快速繁殖，可解决铁皮石斛资源紧缺问题。组织培养主要受培养基和培养条件等因素的共同影响，其中激素种类和浓度是至关重要的[9-10]。试验分别用种子和茎段作为外植体，研究了不同基本培养基、激素配比、有机添加物对铁皮石斛种子萌发、原球茎增殖、分化和生根壮苗的影响，并对茎段发芽、生根壮苗长势和时间进行了比较，筛选出适合各个培养阶段的培养基配方。在铁皮石斛的组织培养中，生长调节剂对各阶段的生长分化促进作用明显，该试验与唐桂香等[11]的研究相似。从工厂化生产育苗角度来看，苗的整齐度以及一定时间内生产大量的瓶苗，种子扩繁优于茎段，主要体现在起步阶段的种子外植体感染率有效降低，种子的增殖倍数高于茎段。加上铁皮石斛的种子数量极多，快速繁殖可利用这一优势，利用种子进行非共生萌发，进而不断地分化和增殖，产生种苗，因此这一途径是种苗工厂化生产的重要途径[12]。种子萌发适宜的诱导培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶；增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶；生根培养基为1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉胶。

铁皮石斛在兰花瓶内与在聚丙烯透明薄膜袋内的长势、生长周期方面没有明显的差异[13]，但是薄膜袋质地轻，体积小，不易破损，装箱和搬运方便，便于运输和推广，可减少回收和清洗容器的工序，达到省工、省时、省钱的目的，同时也给铁皮石斛种植者带来极大的方便，洗苗时对苗的损伤极小。袋培苗在降低生产成本、提高生产效率上有显著优势，完全可以取代瓶培苗，但在操作工序上有一定的要求，在灌装与高压时必须保证培养基不得粘在袋口；没有封口的培养基要及时接种并密闭袋口。袋培苗后期培养与炼苗污染率降低，其主要原因是袋培苗在接种后即用封口机将袋口全部封死，避免了培养过程中的2次污染。 而瓶式培养采用螺旋塑料盖，难免存有空隙或松动，真菌孢子等易随空气进入瓶内造成污染[14]。笔者认为袋式培养在铁皮石斛组织培养中是切实可行的，可以广泛推广应用。

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