宫颈病变组织中抗增殖蛋白表达与HR-HPV相关性研究

周莹，冯博，王英红

（石河子大学医学院第一附属医院妇产科，新疆 石河子 832000）

宫颈病变组织中抗增殖蛋白表达与HR-HPV相关性研究

周莹，冯博，王英红

（石河子大学医学院第一附属医院妇产科，新疆 石河子 832000）

为探讨抗增殖蛋白（Prohibitin，PHB）在宫颈病变组织中的表达与高危型HPV（HR-HPV）的关系。方法：选取采集2014年1月-2015年12月在我院经病理诊断为宫颈病变的132例的患者宫颈组织，分为慢性宫颈炎39例，宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ级23例，CINⅡ级-Ⅲ级28例，宫颈鳞癌42例。采用免疫组织化学检测方法检测组织中PHB的表达，杂交捕获二代（HC2）法检测患者宫颈分泌物中HR-HPV-DNA的载量。结果显示：PHB在不同宫颈病变组织中有不同程度的阳性表达，PHB的强阳性率随病变程度的增加逐渐升高，慢性宫颈炎组、CINⅠ级组、CINⅡ-Ⅲ级组、宫颈鳞癌组中PHB的强阳性率分别为35.9%、47.8%、57.1%、71.4%，差异有统计学意义（P＜0.01）。PHB阳性表达、HR-HPV感染载量均与宫颈病变程度呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.01）。PHB与HR-HPV之间无相关关系，差异无统计学意义（P＞0.05）。PHB在宫颈鳞癌组的表达与年龄、分化程度、临床分期不相关，差异无统计学意义（P＞0.05）。由此可知，PHB的过表达及HR-HPV的感染可能从不同途径促进了宫颈癌的发生发展，PHB可能成为宫颈癌潜在的诊断标记物及治疗靶点。

宫颈鳞癌；宫颈上皮内瘤样病变；抗增殖蛋白(PHB)；人乳头瘤病毒（HPV）

宫颈癌(cervical carcinoma)是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁广大女性健康，其中绝大多数新发病例出现在发展中国家。国内外研究表明高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宫颈癌及宫颈癌前病变的必要条件。

抗增殖蛋白（prohibitin,PHB）是一种高度保守的蛋白，广泛分布于多种真核生物细胞中，参与细胞的能量代谢、增殖、凋亡和衰老等过程[1-2]。研究显示，PHB在多种肿瘤中异常表达，调控细胞增殖、迁移、存活和凋亡[3-6]。常燕及TSAI等[7-8]研究发现PHB在宫颈癌中表达升高，且与宫颈病变程度呈正相关，但无研究证明PHB与高危型HPV感染有无关系。本研究旨在讨论PHB在宫颈病变中的表达及其与高危型HPV感染的相关关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料

宫颈组织标本取自2014年1月-2015年12月在新疆石河子市石河子大学第一附属医院就诊的患者，经阴道镜下宫颈组织活检或全子宫切除术获取，病理诊断为宫颈病变的宫颈组织标本，共132例，患者年龄18-84岁，中位年龄47岁。其中慢性宫颈炎39例，宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ 级23例，CINⅡ级-Ⅲ级28例，宫颈鳞癌42例。其中宫颈鳞癌组又根据分化程度、临床分期的不同进行进一步分组，按照分化程度：高分化6例，中分化31例，低分化5例；按 FIGO临床分期：Ⅰ期 6例，Ⅱ-Ⅲ期 36例。所有患者在标本采集前均未进行过放疗或化疗，标本采集前3天内无性生活、阴道冲洗及用药。宫颈组织标本采集的同时或术前采集HPV。所有标本均由两位高年资病理医师诊断确诊。

1.2 研究方法

1.2.1 PHB检测

采用Envision免疫组化法检测宫颈组织中PHB蛋白的表达，小鼠抗人Prohibitin单克隆抗体（ab1836）购自 Abcam公司，免疫组化 Envision染色试剂盒，购自北京中杉金桥生物科技有限公司。实验中阴性对照采用PBS代替一抗，阳性对照采用说明书上提供的阳性组织切片。石蜡切片脱蜡水化后，高压修复抗原8 min后使用3%H2O2甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶10 min，滴加一抗（1：200）4℃过夜，滴加生物素标记的二抗37℃孵育30分钟，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。

1.2.2 HPV采集与检测

使用第二代杂交捕获法专用HPV采样刷采集患者宫颈分泌物及脱落上皮，置于含有保存液的专用小瓶中，标记研究对象编码，4℃冰箱保存。采用美国Digene公司第二代杂交捕获技术（Hybird Capture2技术,HC2）进行HR-HPV-DNA的检测，该检测方法主要利用基因杂交、信号扩大的原理，检测试剂盒（5197-1330）购自上海莱特公司，主要采用96孔板法，同时检测13种的HR-HPV-DNA的载量（包括 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型）。具体检测方法为：（1）将样本DNA双链释放并分解为可以杂交的核苷酸单链；（2）核苷酸DNA单链与RNA探针杂交；（3）特异抗体捕获DNA-RNA杂交体并固定；（4）联有碱性磷酸酶的第2抗体与DNA-RNA杂交体结合；（5）反复冲洗多次至干燥；（6）信号放大，由DML2000微量反应板测量光的强弱，确定DNA-RNA杂交体的含量，即HR-HPV载量。

1.3 结果判定

1.3.1 免疫组化结果判定

显微镜下观察细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，根据着色强度及阳性细胞百分比进行综合评分[3]：阳性细胞着色强度（I）分为四个等级：无染色（0），黄色（1），棕黄色（2）和棕褐色（3）；阳性细胞的百分比（II）分为五个等级：≤5%（0），6%–25%（1），26%-50%（2），51%–75%（3）和＞75%（4）。根据（I）×（II）的结果，判定 PHB 表达为阴性（0），弱阳性（1-3），中等阳性（4-7）和强阳性（8-12），分别记为（-）、（+）、（++）、（+++）。

1.3.2 HC2法检测HPV结果判定

仪器判读的结果≥1.00时，HR-HPV的检测结果为阳性；＜1.00时为阴性。其中阳性的结果可根据病毒载量的高低分为三组：低载量组（1.00,100.000）、中载量组（100.00,1000.00）、高载量组（>1000.00），按其感染程度可分别记为（+）、（++）、（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。结果采用Kruskal-Walli H检验，以P<0.05为差异有统计学意义。相关性研究采用Spearman进行相关分析。

2 结果

2.1 PHB在宫颈病变组织中的表达

免疫组化显示PHB在慢性宫颈炎、CINⅠ级、CINⅡ-Ⅲ级、宫颈鳞癌中均有不同程度的阳性表达，其阳性表达主要位于细胞质，呈黄色颗粒（图1）。慢性宫颈炎、CINⅠ级、CINⅡ-Ⅲ级、宫颈鳞癌组中PHB表达强阳性率（+++）分别为35.9%；47.8%、57.1%、71.4%，PHB的强阳性率随病变程度的增加逐渐升高，通过Kruskal-Walli H检验，PHB的表达在宫颈病变组织中的表达有统计学意义（Hc=11.552，P＜0.01），根据Spearman相关分析显示，PHB表达的强度与宫颈病变的程度呈正相关（相关系数rs=0.291，P＜0.01），宫颈病变程度越高，PHB的表达越强，范围越广（表 1）。

图1 PHB在宫颈病变组织中的不同表达程度Fig.1 The expression level of PHB in cervical lesions

图2 PHB在不同宫颈病变组织中的表达Fig.2 The expression of PHB in different cervical lesions

表1 PHB在宫颈病变组织中的表达Tab.1 the expression of PHB in cervical lesions

2.2 高危型HPV在宫颈病变组织中的表达

不同宫颈病变程度的宫颈组织感染HR-HPV的量不同，宫颈病变程度越高，HPV-DNA载量越高，通过Kruskal-Walli H检验，差异有统计学意义（Hc=31.746，P＜0.01），根据不同宫颈病变组的秩均值及Spearman相关分析显示，HPV-DNA感染程度与宫颈病变程度成正相关（rs=0.445,P＜0.01），宫颈病变程度越高，HR-HPV感染越多，HPV-DNA载量越高（表2）。

表2 HR-HPV在宫颈病变组织中的表达Tab.2 The expression of HR-HPV in cervical lesions

2.3 PHB与高危型HPV的关系

通过Spearman相关分析，PHB在宫颈组织中的表达与HR-HPV感染之间无明显相关关系（rs=0.117，P=0.181＞0.05）（表 3）。

表3 PHB的表达与高危型HPV感染的相关关系Tab.3 Correlation between PHB expression and HR-HPV infection

2.4 宫颈鳞癌组织中PHB表达水平及与临床病理特征的关系

42例宫颈鳞癌组织中PHB无阴性表达，阳性的表达水平与患者年龄、分化程度、FIGO分期均无相关关系，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表4 宫颈鳞癌中PHB的表达与临床病理特征的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of the expression of PHB and the clinical pathological characteristics in cervical squamous cell carcinoma

3 讨论

据国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer,IARC）研究数据显示[9]，目前宫颈癌在女性恶性肿瘤中发病率全球排名第四，2012年全世界宫颈癌新发病例52.8万，死亡病例26.6万，其中我国新发病例6.2万，死亡病例3万。尽管近几年我国已经开展了大规模的宫颈癌筛查，宫颈癌的发病率和死亡率仍较高，且年龄水平日趋降低。因此，寻找敏感度及特异度强的分子标记物，尽早识别具有高风险进展的癌前病变，优化宫颈癌筛查及治疗尤为重要。

PHB是广泛存在于真核细胞生物中的一种高保守蛋白，分布于细胞线粒体内膜、细胞核、细胞膜和基质中，主要定位于线粒体内膜上，PHB家族包含PHB1和PHB2两个成员，因其具有抗细胞增殖作用而得名[10]。PHB分布广泛、结构高度保守、其生物学功能多样[1]，PHB主要以分子伴侣的形式来维持线粒体结构及功能，通过参与线粒体能量代谢进而参与调控细胞增殖、分化、凋亡、信号转导等过程[11]。多项研究显示，PHB在多种不同的肿瘤组织中异常表达[3-4,6,8,12-14]，推断其在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，可能成为肿瘤组织潜在的生物标志物及治疗靶点。

本研究显示，PHB在不同宫颈病变程度中呈现不同程度的阳性表达，PHB在慢性宫颈炎组织、CINⅠ级组、CINⅡ-Ⅲ级组、宫颈鳞癌组中强阳性表达率随宫颈病变程度增加逐渐升高，分别为35.9%、47.8%、57.1%、71.4%，宫颈病变程度越高，PHB的强阳性表达率越高。此结果与常燕[7]研究成果基本相符，PHB在不同分组中呈现不同程度的阳性表达提示PHB参与宫颈上皮细胞正常能量代谢、信号转导、细胞衰老、凋亡等过程，但随着宫颈组织病变的进展，PHB表达程度逐渐升高，提示PHB的过表达可能是慢性宫颈炎向宫颈癌逐渐进展的诱因之一，PHB的过表达可能与肿瘤细胞中无氧糖酵解的水平增加促进PHB启动子中的调控因子与原癌基因的肿瘤蛋白相结合，进而上调原癌基因的表达，诱导PHB进一步增多[15]。PHB的表达可做为预示宫颈病变发生不良结局可能性的指标之一。

PHB的表达与宫颈鳞癌临床病理特征分析的研究中，PHB的表达与年龄、分化程度、FIGO分期无关，说明PHB在判断宫颈鳞癌分期及分化程度方面的作用不大。PHB与宫颈鳞癌淋巴转移、肿瘤大小等方面的有无作用尚需进一步研究。

国内外大量研究均显示HR-HPV持续性感染是导致宫颈癌前病变及宫颈癌最主要的因素[16]，且HPV病毒载量与宫颈病变程度密切相关[17]。本研究结果显示,HR-HPV感染的阳性率及病毒载量与宫颈病变程度有关，且呈正相关，宫颈病变程度越高，HPV感染阳性率越高，病毒裁量越高。此结果与国内外研究结论相符。HR-HPV持续高载量感染是导致宫颈恶性病变的重要因素，治疗HR-HPV感染仍是预防宫颈病变向宫颈恶性肿瘤进展的主要方向。

PHB的过表达与HR-HPV均与宫颈病变程度呈正相关，但PHB的表达程度与HR-HPV感染之间的相关性分析显示不相关，由此可认为PHB的过表达以及HR-HPV感染均可促进宫颈癌前病变及宫颈癌的发生发展，但具体导致宫颈病变进一步向不良结局进展的途径可能不同，相关机制仍需进一步研究证明。

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Expressions of prohibitin in cervical lesions and the relationship with HR-HPV

Zhou Ying,Feng Bo,Wang Yinghong
(Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832008,China)

To explore the expressions of PHB in cervical lesions and their relationships with HR-HPV infection,a total of 132 patients diagnosed as cervical lesions by pathological examination in the hospital from January 2014 to December 2015 were selected and divided into chronic cervicitis group(39 patients)，CIN Ⅰ group(23 patients)，CIN Ⅱ-CIN Ⅲ group(28 patients),cervical squamous cell carcinoma group(42 patients).Immunohistochemical method was used to detect the expressions of PHB.HC2 technique was used to detect HR-HPV DNA in cervical secretions.The resalts showed the degree of positive expression of PHB in different cervical lesions group were different.The high-positive expression rates of PHB in chronic cervicitis group，CINⅠ group，CIN Ⅱ-CIN Ⅲ group and cervical squamous cell carcinoma group were 35.9%，47.8%，57.1%，71.4%,respectively.There were statistically significant differences (P＜0.01).The positive expression of PHB and HR-HPV infection were positively correlated with the degree of cervical lesions(P＜0.01) ，but there was no correlation between PHB and HR-HPV(P＞0.05).The expression of PHB in cervical squamous cell carcinoma was not correlated with age，degree of differentiation，FIGO staging.There was no statistically significant difference (P＞0.05).The conclusion is that overexpression of PHB and HR-HPV infection maybe promote the development of cervical cancer in different ways.PHB could become a potential marker for diagnosis and treatment of cervical cancer.

cervical carcinoma;Cervical intraepithelial neoplasia;prohibitin,PHB;human papillomavirus，HPV

R711.74

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.009

1007-7383(2017)02-0182-05

2016-12-25

科技部科技惠民计划（2013GS650104）

周莹（1990-），女，硕士研究生，专业方向为妇科肿瘤学。

*通信作者：王英红（1960-），女，教授、主任医师，从事妇科肿瘤与内镜研究，e-mail：wyhxj920@sina.com。