HPLC法测定丙戊酸钠血药浓度柱前衍生化条件的优化

胡雪飞，张永军*，魏丽红,陈文

（1石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832002）

HPLC法测定丙戊酸钠血药浓度柱前衍生化条件的优化

胡雪飞1，张永军2*，魏丽红2,陈文1

（1石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832002）

为了研究HPLC法测定丙戊酸钠血药浓度衍生时的最佳衍生条件，探讨不同衍生条件对血药浓度的影响，本实验采用L9（34）正交实验设计，以衍生试剂浓度、催化剂浓度、衍生温度和衍生时间为考察因素，确定最佳衍生条件。结果显示，A2B2C3D1为最佳衍生条件，即衍生试剂为2.0 mg/mL，催化剂浓度为20%，衍生温度为60℃，衍生时间5 min为最佳衍生条件。不同的衍生条件对测定结果有显著影响（P＜0.05），且衍生反应的主次因素为衍生试剂浓度>衍生温度>催化剂浓度>衍生时间。由此可知，优化后的衍生条件方法回收率高，节约时间和成本，简便可行。

衍生条件；丙戊酸钠；血药浓度；正交实验；优化

丙戊酸（valproic acid，VPA）钠是临床上常用的一线抗癫痫药，是癫痫综合征、大发作、失神性发作、肌阵挛性发作的首选。但它在临床应用中，治疗范围窗窄，个体差异较大，血药浓度易受药物间相互作用的影响[1]，故丙戊酸钠需要进行血药浓度监测。高效液相色谱（HPLC）法是临床测定丙戊酸钠血浆药物浓度常用的方法之一[2]。由于丙戊酸钠分子结构中没有能够产生紫外吸收的结构，需对样品进行衍生化前处理[3]才能用高效液相色谱法进行测定。血浆生物样品的柱前衍生，直接影响血药浓度监测的结果，进而影响临床给药方案的调整 。目前，文献报道柱前衍生高效液相色谱（HPLC）法测定丙戊酸钠血药浓度较多，但仅仅只是对方法学进行了考察，并未见衍生条件优化的相关报道。因此，本实验在单因素分析的基础上采用正交设计法考察不同条件组合对HPLC测定丙戊酸钠血药浓度的影响，并确定出最佳衍生条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

Agilent-1100高效液相色谱仪，包括惠普化学工作站，G1322A在线脱气机，G1311A四元泵，G1314A紫外检测器，色谱柱：Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，氮吹仪(青岛聚创环保设备有限公司，型号WD-12型)，高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂，型号TGL-20B)，漩涡混合器 (上海琪特分析仪器有限公司，型号QT-1)，标准试剂超纯水机（青岛富勒姆科技有限公司，FBZ1002-UP-P）

1.1.2 试剂与药品

丙戊酸钠标准品(中国食品药品检定研究院；批号100963-201302；含量99.0% 以上)；2-溴-对硝基苯乙酮（英国SIGMA-ALDRICH，批号#BCBB1161V，含量95%）、环己烷羧酸（英国SIGMA-ALDRICH，批号#MKBD6586V，含量 98.0%），色谱甲醇（Fisher Scientific，LOT 676535）、色谱乙腈（Fisher Scientific，LOT 082333），硫酸（四川西陇化工有限公司，含量95.0%~98.0%）、正己烷(天津市富宇精细化工有限公司，含量95.0%)、乙腈（天津市富宇精细化工有限公司，含量99.9%)，三乙胺（天津市富宇精细化工有限公司，含量 99.0%)）。

1.2 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相（v:v）：乙腈 - 水（75:25），流速：1.0 mL/min，检测波长265 nm，柱温30℃，保留时间12 min，进样量 20 μL，内标：0.4 mg/mL环己烷羧酸。

1.3 溶液的配制

标准品溶液：精密称定12 mg丙戊酸钠标准品粉末，置10 mL棕色容量瓶中，用超纯水定容，得到12.0 mg/mL的丙戊酸标准液。置4℃冰箱保存，临用时用超纯水稀释成不同浓度的标准溶液。

内标溶液：精密量取环己烷羧酸10.0 μL，置25 mL容量瓶中，用0.5 mol/L氨水定容，得到0.4 mg/mL的环己烷羧酸内标液，置4℃冰箱保存。

衍生试剂溶液：精密称定2-溴4-对硝基苯乙酮粉末45.0 mg，置25 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，得到1.80 mg/mL的衍生试剂，4℃冷藏保存备用。

1.4 样品处理方法

精密量取血浆200 μL放入4 mL离心管中，加 100 μL的环己烷羧酸和 100 μL H2SO4（3 mol/L），涡旋1 min，充分混匀后，再加入 2 mL正己烷提取，涡旋1.5 min混匀，以14000 r/min转速离心10 min，取上清液1 mL，加入200 μL衍生试剂（2-溴-4-基苯乙酮）和20 μL催化剂（纯三乙胺），在60℃水浴中衍生 10 min，N2吹干，干燥后的固体用200 μL乙腈溶解，离心后，取上清液进样（20 μL）。

1.5 方法学考察

1.5.1 标准曲线的制备

用1.2 mg/mL丙戊酸钠标准液稀释成浓度为200、150、100、75、50、25、10 μg/mL系列浓度的丙戊酸钠标准品。按“1.4样品处理方法”制备，以丙戊酸钠浓度为横坐标，丙戊酸钠衍生物峰面积与内标衍生物峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.2 单因素衍生条件的考察

（1）衍生试剂浓度的考察

精密称取150.0 mg 2-溴-4-硝基苯乙酮于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，即得15.0 mg/mL的衍生试剂贮备液。量取适量的贮备液，配制成浓度为 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的衍生试剂溶液。配置75 μg/mL的丙戊酸钠对照品血浆，按“1.4样品处理方法”制备(不加内标)，分别测定上述不同浓度衍生试剂衍生时丙戊酸衍生物的峰面积，以最大的峰面积为参比，计算丙戊酸衍生物的产率。

（2）三乙胺浓度的考察

精密移取适量的纯三乙胺，用乙腈稀释，分别配制成体积比为0.2%、20%、40%、60%、80%的三乙胺溶液。用75 μg/mL的丙戊酸钠对照品血浆，按“1.4样品处理方法”制备，分别测定上述不同浓度三乙胺作催化剂时，丙戊酸衍生物的峰面积，计算丙戊酸衍生物的产率。

（3）反应时间与温度的考察精密量取75 μg/mL的丙戊酸钠标准品血浆200 μL，按“1.4样品处理方法”制备，分别测定衍生温度在50-65℃，衍生时间5、10、15 min时丙戊酸衍生物的峰面积。计算丙戊酸衍生物的产率。

1.5.3 正交实验优化衍生条件

选择衍生温度、衍生时间、衍生试剂浓度、三乙胺浓度4个主要影响因素作为考察因素。根据单因素考察，每个因素选取3个水平（因素水平表见表1），采用L9（34）正交表进行实验。精密量取浓度分别为100 μg/mL丙戊酸钠血浆标准品200 μL，根据L9（34）正交表所列的9个随机组合，按“1.4”样品处理办法进行实验，所得丙戊酸衍生物面积与内标面积的比值代入标准曲线，计算实际测量浓度。每个实验重复3次，取平均值。以丙戊酸钠血药浓度方法回收率为指标，判断不同衍生方案的最佳组合。方法回收率=测定值/标准值。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

1.5.4 最佳衍生条件的验证

精密量取浓度100 μg/mL血浆丙戊酸钠标准品200 μL，按最佳组合方案，测定丙戊酸钠的实际浓度，计算方法回收率。

1.5.5 提取回收率与精密度实验

精密量取线性范围内低、中、高三个浓度（10、75、200 μg/mL）的丙戊酸钠标准液 200 μL，按“1.4样品处理方法”制备，与未加空白血浆的同法衍生后的丙戊酸-内标之比计算提取回收率。1 d内重复测定5次，为日内变异；连续5 d内，每天测定1次，为日间变异。

1.5.6 稳定性实验

精密量取线性范围内低、中、高三个浓度的（10、75、200 μg/mL）的丙戊酸钠标准液 200 μL，按“1.4样品处理方法”制备，于 0 h，室温 24 h，冰箱（4℃）保存48 h，72 h的样品，分别测定丙戊酸钠的药物浓度。

2 结果与分析

2.1 专属性

在“1.2”项色谱条件下，以空白血浆、空白血浆+丙戊酸钠对照品+内标、癫痫患者服药后的血浆+内标，按“1.4样品方法制备处理后测定，得出的色谱图如图1所示，丙戊酸钠衍生物和环己烷羧酸衍生物的保留时间分别是6.5 min和9.6 min左右，且分离良好，峰形瘦高，血浆中内源性杂质杂质及环己烷羧酸不干扰丙戊酸钠的测定。

图1 高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography

2.2 标准曲线及定量下限

根据“1.5”标准曲线样品处理办法制备样品，得出标准曲线：Y=0.0047X+0.0015(R2=0.9995，Y表示丙戊酸钠与内标峰面积的比值，X表示丙戊酸钠的浓度)。结果表明，丙戊酸钠血浆药物浓度在10-200 μg/mL范围内呈良好线性关系，其最低定量浓度为 8.62 μg/mL（S:N=10）。

2.3单因素衍生条件的考察

2.3.1 衍生试剂浓度的考察

对衍生试剂浓度的考察结果如图2所示。结果表明，随着衍生试剂浓度的增大，丙戊酸衍生物产率也逐渐增加。当衍生浓度≥2.0 mg/mL时，衍生产率趋于平稳，但基线存在漂移现象。由此可知，衍生衍生浓度≥2.0 mg/mL时，衍生试剂就会变成杂质，干扰药物浓度的测定。

图2 不同浓度2-澳-4-硝基苯乙酮对产率的影响Fig.2 Effect of different concentrations of 2-bromine-4-ouetopnenone on the derivatization reaction

2.3.2 催化剂浓度的考察

催化剂浓度的考察结果如图3所示。结果表明，随着三乙胺浓度百分比的增大，丙戊酸钠衍生产率先增加后减小。在浓度百分比为20%时，丙戊酸钠衍生产率达到最大。

图3 不同浓度三乙胺对衍生化反应的影响Fig.3 Effect of different concentrations of triethylamine on the derivatization reaction

2.3.3 反应时间与温度的考察

衍生温度与时间的考察结果如图4所示。由图4可知，衍生时间10 min优于15 min，而5 min和10 min的衍生产率接近，且丙戊酸钠衍生产率一直在95%以上。表4说明衍生时间对丙戊酸钠衍生产率的影响不是特别大。由于60℃接近提取溶剂正己烷的沸点，有利于有机溶剂的挥干，节约N2挥干的时间，因此，60℃可能是最佳衍生温度。

图4 不同温度、时间对衍生反应的影响Fig.4 Effect of different temperatμre and time on the derivative reaction

2.4 正交实验优化衍生条件

正交实验结果表2所示。根据正交实验可以直观地看到，不同的衍生条件，其测定值与标准值的偏差很大。通过对9组不同衍生条件所得出的测定值进行单样本 t检验，得出 t=38.035；P<0.001，说明不同的衍生条件对HPLC法测定丙戊酸钠血药浓度有显著的影响。丙戊酸钠的有效血药浓度范围为50-100 μg/mL，治疗窗比较窄，由表2可知，不同的衍生条件下，血药浓度测定值的极差是24.84，偏度为 0.475，95%CI（107.70-121.60）。这种在测定时出现的误差，有可能会导致在调整剂量时，剂量过小而癫痫不能控制，也有可能调整剂量过大，而导致不良反应的发生。因此，血药浓度测定值的准确性对调整给药方案有重大意义。

表2 正交实验结果Tab.2 Results of orthogonal design

影响因素方差分析如表3所示。通过方差分析表明，4个因素之间的主次关系为：衍生试剂浓度(C)>衍生温度(A)>催化剂浓度(D)>衍生时间(B)。结合正交实验结果和方差分析表，我们可以看出，第五组为最佳组合，即衍生试剂浓度为2.0 mg/mL，催化剂浓度为20%，衍生温度为60℃，衍生时间为5 min时，方法回收率最高，衍生效果最好。

表3 影响因素方差分析Tab.3 Variance Analysis of main factors

2.5 最佳衍生组合的验证

最佳衍生组合验证的结果见表4。在最佳衍生优化组合下，即衍生条件为：衍生试剂浓度为2.0 mg/mL，催化剂浓度为20%，衍生温度为60℃，衍生时间为5 min，按照“1.4样品处理方法”制备，结果显示，所得实际测定值与真实值（100 μg/mL）偏差较小，方法回收率较高。

表4 最佳衍生组合的验证Tab.4 validation of the optimal combination of derivatives

2.6 优化后标准曲线的制备

按“1.5”的标准曲线处理方法，以2.0 mg/mL的2-溴-对硝基苯乙酮为衍生试剂，20%的三乙胺为催化剂，衍生温度为60℃，衍生时间为5 min，制备标准曲线。以丙戊酸钠浓度为横坐标，丙戊酸钠与内标峰面积的比值为纵坐标，得出标准曲线：Y=0.00469X+0.00604(R2=0.9995)。结果表明，丙戊酸血药浓度在10~200 μg/mL范围内呈良好线性关系（RSD≤5%，n＝5）。

2.7 提取回收率与精密度

提取回收率和精密度实验结果见表5。结果表明，所建立的HPLC法提取回收率88.48%-96.32%之间，方法回收率在95.00-99.73%之间，日内、日间变异均RSD<5%，符合国家生物样品检测标准。

表5 回收率和精密度结果Tab.5 Results of recovery and precision n＝5

2.8 稳定性

样品的稳定性实验如表6所示。由表6可知，日间、日内RSD<5%，说明丙戊酸钠衍生物样品稳定。

表6 丙戊酸钠的稳定性Tab.6 the stability of sodium valproate n=3

2.9 丙戊酸钠血药浓度监测临床应用

56例服用丙戊酸钠缓释片的成年癫痫患者，年龄在18-72岁，根据患者病情的轻重程度，服药剂量500-2000 mg/d不等，监测患者的稳态血药浓度浓度（谷浓度）。结果显示，在治疗窗（50-100 μg/mL）之内34例，占总人数的60.71%；低于治疗窗＜50 μg/mL的患者 12例，占总人数的21.43%；高于治疗窗＞100 μg/mL的患者10例，占总人数的17.86%。由此可以看出，血药浓度在有效血药浓度范围的癫痫患者接近40%左右。为了减少不良反应的发生，提高疗效，临床药师及医生应加大血药浓度监测宣传力度。并且医生应根据患者具体的病理生理情况、癫痫控制情况、不良反应情况及丙戊酸钠血药浓度监测结果，进行个体化给药。

3 讨论

丙戊酸钠作为临床上最常用的广谱抗癫痫药之一[7]，它的治疗药物监测结果的准确准确性直接影响个体化给药的治疗方案。临床上丙戊酸钠的有效血药浓度范围是50-100 μg/mL，有时也可放宽至40-100 μg/mL。大量血药浓度监测结果表明，当浓度<40 μg/mL时，癫痫发作可能控制未得到很好的控制；当浓度>120μg/mL时，出现不良反应的几率会大大增加。因此，血药浓度监测结果的准确性将直接影响临床给药方案的调整。尤其是当测定结果在有效血药浓度边界范围，同时又是特殊代谢的患者（如快/慢代谢型患者）或者合并用药患者 ，根据血药浓度减量/加量时，将直接导致患者癫痫的再次发作或者出现不良反应。因此，临床测定结果的准确性十分重要[9]。用HPLC法测定丙戊酸钠血药浓度时，测定结果的不同主要是由柱前衍生反应情况的不同造成的。而各文献报道用HPLC法测定丙戊酸药物浓度的衍生条件很不一致[10-13]，并且不同衍生条件对测定结果的影响未见报道。因此，实验先以丙戊酸衍生产率为指标，单因素考察衍生试剂浓度、催化剂浓度、衍生温度和时间的范围，再用正交实验优化衍生条件。结果表明衍生试剂为2.0 mg/mL，催化剂体积比为20%，丙戊酸衍生物产率最大。实验证明，不同衍生条件对血药浓度测定结果具有显著影响。衍生条件为衍生试剂浓度2.0 mg/mL，催化剂浓度为20%，衍生温度为10℃，衍生时间为5 min时，测定值最接近真实值，血药浓度方法回收率最好。影响衍生反应的主次因素为衍生试剂浓度>衍生温度>催化剂浓度>衍生时间。

因此，用柱前衍生HPLC法测定丙戊酸血药浓度时，应当注意衍生条件的变化。如果衍生试剂浓度、催化剂浓度、衍生温度或时间等任一因素改变时，我们应该重新建立标准曲线。当然，影响丙戊酸钠血药浓度监测结果还包括仪器因素（如色谱柱选择、柱温、流动相等）及前处理（如提取回收率、稳定性、蛋白去除效率等）等很多方面。由实验方法学考察可知，在所选色谱条件下，最佳衍生条件为衍生试剂浓度2.0 mg/mL，催化剂浓度为20%，衍生温度为10℃，衍生时间为5 min时，所建立的方法稳定、可靠，适用于常规丙戊酸钠血药浓度监测。准确的测定结果能为判断分析疗效及制定个体化给药方案提供可靠依据。在日常血药浓度监测过程中应注意确保丙戊酸钠治疗药物监测结果的准确性，为临床调整剂量提供依据。

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Optimization of derivatization conditions by orthogonal experiment of monitoring serum concentration of sodium valproate

Hu Xuefei1,Zhang Yongjun2*,Wei Lihong2,Chen Wen1
(1 School of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 The First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

In order to optimize the derivatization conditions when the HPLC method was adopted to monitoring the serum concentration of sodium valproate,and investigate the influence of different derivatization conditions on serum concentration of sodium valproate,L9（34） orthogonal experimental design was used to determine the optimal derivatization conditions,the concentration of derivatization reagent,catalyst concentration,temperature and time was used as study factors.Results showed that A2B2C3D1combination was the optimal derivation conditions,so the best derivation condition was that the concentration of derivatization reagent was 2.0 mg/mL,the catalyst concentration was 20%,the reaction temperature was 60℃,and time was 5 min.Different derivatization conditions had a significant effect on the determination results(P<0.05).The primary and secondary factors for the derivatization reaction were derived reagent concentration> derived temperature> catalyst concentration>derivatization time.These findings in our research showed thatthe optimized derivation condition method had high recovery rate,saves time and cost,and simple and feasible.

Derivative conditions;sodium valproate;serum concentration;orthogonal design；optimization

R927.2

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.008

1007-7383(2017)02-0176-06

2016-11-25

新疆兵团工业高新技术科技攻关与成果转化项目（2015AB030）

胡雪飞（1989-）女，硕士研究生，专业方向为临床药学。

*通信作者：张永军（1972-），男，主任药师，从事医院药学与临床药学研究，e-mail：zyjyjk@sina.com。