泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核杆菌耐药性的影响研究

张帅，吴芳，吴江东，章乐，朱荟云，张大龙，武青青，张万江*

（1石河子大学医学院病理生理学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832003；2石河子大学医学院第一附属医院重症医学科，新疆 石河子 832002）

泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核杆菌耐药性的影响研究

张帅1，吴芳1，吴江东1，章乐1，朱荟云1，张大龙2，武青青2，张万江1*

（1石河子大学医学院病理生理学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832003；2石河子大学医学院第一附属医院重症医学科，新疆 石河子 832002）

为探讨泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核杆菌耐药性的影响及其机制。采用刃天青显色法，比较单耐异烟肼结核杆菌（对照组）与4种基因（Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因）过表达的单耐异烟肼结核杆菌菌株和4种相同基因缺失突变的单耐异烟肼结核杆菌菌株异烟肼最低抑菌浓度（MIC）值的差异；比较在应用外排泵抑制剂后，单耐异烟肼结核杆菌（对照组）与4种基因（Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因）过表达的单耐异烟肼结核杆菌菌株和4种相同基因缺失突变的单耐异烟肼结核杆菌菌株异烟肼MIC差值间的差异。结果显示：（1）与单耐异烟肼结核杆菌相比，过表达PafA基因的该菌株异烟肼的MIC值增加了1.03 μg/mL，过表达Dop、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC值分别降低了1.03 μg/mL、0.68 μg/mL,差异均无统计学意义(P>0.05);与单耐异烟肼结核杆菌相比,过表达Pup基因的该菌株异烟肼的MIC值增加了8 μg/mL，缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC值分别降低了4.82、4.98、4.99、4.9 μg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)与在应用外排泵抑制剂后单耐异烟肼结核杆菌相比,过表达Pup基因的该菌株异烟肼的MIC差值增加了8 μg/mL，缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC差值分别降低4.65、4.81、4.83、4.75 μg/mL，差异均有统计学意义(P<0.05)；与在应用外排泵抑制剂后单耐异烟肼结核杆菌相比,过表达Dop、PafA、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC差值分别降低了1、0.99、0.65 μg/mL，差异均无统计学意义(P>0.05)。由此可知，结核杆菌泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核杆菌耐药性的产生有调控作用，其作用机制可能是通过调控单耐异烟肼结核杆菌外排泵的功能来调控其耐药性的产生。

结核杆菌；泛素样蛋白-蛋白酶体系统；耐药性；异烟肼；机制

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核杆菌感染引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。在我国结核杆菌耐药菌株的出现，患HIV人数的增加以及结核病的潜伏感染使结核病疫情进一步严峻，更加急需寻求新的途径来帮助我们解决结核杆菌耐药问题[1]。

结核杆菌泛素样蛋白蛋白酶体系统（Mycobacterium tuberculosis ubiquitin-like protein-proteasome system，MTB PPS)由结核杆菌泛素样蛋白与结核杆菌蛋白酶体组成。该系统介导的蛋白质降解过程中所需的辅助因子有：Dop、PafA、Mpa。MTB PPS 是胞内蛋白降解的重要机制，在去酰胺酶Dop，连接酶PafA，ATP酶Mpa等辅助因子的作用下，Pup可以共价标记多种功能蛋白，并介导被标记蛋白通过蛋白酶体降解[2]。近年研究发现，MTB PPS主要介导和调控结核杆菌菌体内蛋白质的选择性降解，对结核杆菌在宿主体内的生长、分化、代谢、繁殖、渗透调节、持留性、毒性、趋化性、变异性、致病性及其引起的宿主免疫应答等方面发挥着重要的调控作用[3]。被Pup修饰的蛋白质包括了8种功能的蛋白质如中间代谢、脂类代谢、信号转导、毒力等，这暗示Pup的修饰可能是一种全局性的修饰，而且通过修饰介导了原核生物的各种生命活动过程[4]。

本课题组前期研究结果表明：暴露于低浓度抗生素压力下的单耐异烟肼结核杆菌（INH-MTB）菌株与非暴露条件下相比，两种状态下INH-MTB菌株中PPS各基因的表达有差异。在Diana等[5]研究中，将INH-MTB菌株暴露于低浓度抗生素压力下，发现大多数外排泵基因的表达水平增高。同时外排泵活动的增强是导致结核杆菌耐药的机制之一。关于MTB PPS是否与INH-MTB菌株耐药性产生之间具有相关性，以及MTB PPS是否通过调控INH-MTB菌株外排泵的功能来调控其耐药性的产生，国内外尚未见相关报道。

1 材料与方法

1.1 菌株

INH-MTB菌株由新疆地方与民族高发病教育部重点实验室采集样本并鉴定保存，Pup、Dop、PafA和Mpa基因分别缺失突变和过表达的各INH-MTB菌株由本课题组构建并鉴定保存。

1.2 试剂

异烟肼（上海Aladdin有限公司），维拉帕米（上海信谊药厂有限公司），氯丙嗪（上海研生实业有限公司），利血平（上海信谊药厂有限公司），羰基氰氯苯腙（天津希恩斯生化科技有限公司），刃天青（上海Aladdin有限公司），二甲基压枫（山西太谷化工厂），10%的醋酸（天津市坤华化工有限公司），Tween 80（天津化学试剂厂），生理盐水（上海生物工程有限公司），胰蛋白胨OXOID（英国Tryptone公司），酵母提取物OXOID（英国Tryptone公司），OADC细菌增菌液（美国BD公司）。

1.3 结核杆菌的培养及菌悬液的制备

培养 INH-MTB 菌株，Pup、Dop、PafA 和 Mpa基因分别缺失突变和过表达的各INH-MTB菌株至对数生长期，并将其研磨至呈乳酪样，用生理盐水稀释至每种菌悬液浓度为1.0×106/mL。

1.4 配制含不同浓度异烟肼的7H9液体培养基

根据各个菌株预实验中MIC值的不同，将异烟肼通过倍比稀释成不同的浓度梯度。在1-11孔中异烟肼浓度由高至低，第12孔作为对照孔。

1.5 INH-MTB 菌株，Pup、Dop、PafA、Mpa基因分别缺失突变和过表达的各INH-MTB菌株异烟肼MIC值的测定

不同浓度异烟肼的配制，方法如1.4。向含不同浓度异烟肼的酶标板各孔中加入稀释好的菌悬液100 μL，用无菌保鲜膜封板，放入培养箱内，37℃培养5天，第6天加入0.1 g/L刃天青显色液30 μL，至第12孔，继续温育24 h，若第12孔变为粉红色，则加相同剂量的刃天青显色液至其它各孔，24 h后观察并记录各孔的颜色变化情况。颜色由蓝色变为粉色则预示着细菌生长，以保持蓝色的最低药物浓度为该菌株异烟肼的MIC值。每个实验平行7次。

1.6 测定药物外排泵抑制剂对INH-MTB菌株，Pup、Dop、PafA和 Mpa基因分别缺失突变和过表达的各INH-MTB菌株异烟肼MIC值的影响

1.6.1 4种泵抑制剂的配制

维拉帕米、氯丙嗪分别用高压灭菌水配置成浓度为 1140、72 μg/mL的储存液。利血平用10%醋酸进行溶解，灭菌水稀释成384 μg/mL的储存液。羰基氰氯苯腙(CCCP）用二甲基亚砜溶解后加灭菌水稀释成240 μg/mL的储存液。

1.6.2 测定药物外排泵抑制剂对各菌株异烟肼MIC值的影响

每次实验前在7H9培养液中加入药泵抑制剂储存液，使药泵抑制剂维拉帕米、氯丙嗪、利血平、CCCP 的终浓度分别为 142.5、18、96、15 μg/mL（4种外排泵抑制剂的最适浓度为本实验室经过浓度梯度实验筛选确定）。向 1.4中的含有不同浓度异烟肼的无菌微孔酶标板内加入100 μL配置好的外排泵抑制剂浓度如上所述。其余步骤同1.5。每个实验平行7次。

1.7 统计学处理

实验结果采用SPSS17.0统计软件，进行One-Way ANOVA单因素方差分析及LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Pup基因过表达可提高异烟肼的MIC值

所测得INH-MTB菌株、rINH-MTB::Pup菌株（过表达 Pup基因的 INH-MTB菌株）、rINH-MTB::Dop菌株（过表达Dop基因的INH-MTB菌株）、rINH-MTB::PafA菌株（过表达PafA基因的INH-MTB菌株）、rINH-MTB::Mpa菌株（过表达Mpa基因的INH-MTB菌株）异烟肼的MIC值如图1结果所示。与INH-MTB菌株异烟肼的MIC值相比，rINH-MTB::Pup菌株异烟肼的MIC值增加了8μg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)；而与INH-MTB菌株异烟肼的MIC值相比，rINH-MTB::PafA菌株异烟肼的MIC值增加了1.03 μg/mL，rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::Mpa菌株异烟肼的MIC值分别降低了1.03μg/mL、0.68μg/mL，差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1 INH-MTB菌株及其过表达菌株异烟肼的MIC值Fig.1 MIC determination of INH-MTB strain and its overexpression strains to isoniazid

2.2 Pup基因、Dop基因、PafA基因和Mpa基因的缺失均可降低异烟肼的MIC值

所测得INH-MTB 菌株、INH-MTB△Pup菌株（缺失Pup基因的INH-MTB菌株）、INH-MTB△Dop菌株（缺失Dop基因的INH-MTB菌株）、INH-MTB△PafA菌株（缺失PafA基因的INH-MTB菌株）、INH-MTB△Mpa菌株（缺失Mpa基因的INH-MTB菌株）异烟肼的MIC值如图2所示。与INH-MTB菌株异烟肼的MIC值相比，INH-MTB△Pup菌株、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株异烟肼的 MIC 值分别降低了 4.82、4.98、4.99、4.9 μg/mL，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图2 INH-MTB菌株及其缺失突变菌株异烟肼的MIC值Fig.2 MIC determination of INH-MTB strain and its deletion mutant strains to isoniazid

2.3维拉帕米对各菌株异烟肼MIC值影响最大

作用浓度为47.5μg/mL的维拉帕米、6μg/mL的氯丙嗪、32μg/mL的利血平、5μg/mL的CCCP对各菌株异烟肼的MIC值的影响：使INH-MTB菌株异烟肼的 MIC值分别以下降 32、0、0、0倍为主；使rINH-MTB::Pup菌株异烟肼的MIC值分别以下降64、0、2、2 倍为主；使 rINH-MTB::Dop 菌株异烟肼的MIC值分别以下降 32、0、0、0倍为主；使 rINH-MTB::PafA菌株异烟肼的 MIC值分别以下降 32、0、0、0倍为主；使rINH-MTB::Mpa菌株异烟肼的MIC值分别以下降 32、0、0、0为主；使 INH-MTB△Pup菌株异烟肼的 MIC值分别以下降 16、0、2、2倍为主；使INH-MTB△Dop菌株异烟肼的MIC值分别以下降8、0、2、2倍为主；使 INH-MTB△PafA 菌株异烟肼的MIC值分别以下降 4、0、2、2倍为主；使 INH-MTB△Mpa菌株异烟肼的 MIC值分别以下降 8、0、2、2倍为主。

2.4 Pup基因过表达菌株是通过调控其外排泵功能影响耐药性

INH-MTB菌株、rINH-MTB::Pup菌株、rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::PafA菌株、rINH-MTB::Mpa菌株在加用外排泵抑制剂（相同浓度和剂量的维拉帕米）前后异烟肼的MIC差值（图3）。

图3 INH-MTB菌株及其过表达菌株异烟肼的MIC差值Fig.3 The difference value of MIC in INH-MTB strain and its overexpression strains to isoniazid

结果显示：与应用外排泵抑制剂前相比，应用外排泵抑制剂后的INH-MTB菌株、rINH-MTB::Pup菌株、rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::PafA菌株、rINH-MTB::Mpa菌株异烟肼的MIC分别降低了4.95、12.95、3.95、5.94、4.3 μg/mL。与在应用外排泵抑制剂前后INH-MTB菌株异烟肼的MIC差值相比，rINH-MTB::Pup菌株异烟肼的MIC差值增加了8ug/ml，差异有统计学意义(P<0.05)；而与在应用外排泵抑制剂前后INH-MTB菌株异烟肼的MIC差值相比，rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::PafA菌株、rINH-MTB::Mpa菌株异烟肼的MIC差值分别降低了1、0.99、0.65 μg/mL，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5△Pup菌株、△Dop菌株、△PafA菌株、△Mpa菌株是通过调控其外排泵功能影响耐药性

INH-MTB菌株、INH-MTB△Pup菌株、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株在加用外排泵抑制剂（相同浓度和剂量的维拉帕米）前后异烟肼的MIC差值（图4）。结果显示：与应用外排泵抑制剂前相比，应用外排泵抑制剂后的INH-MTB 菌 株 、INH-MTB△Pup菌 株 、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株异烟肼的 MIC分别降低了 4.95、0.3、0.14、0.12、0.2μg/mL。与在应用外排泵抑制剂前后INH-MTB菌株异烟肼的 MIC差值相比，INH-MTB△Pup菌株、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株异烟肼的MIC差值分别降低 4.65、4.81、4.83、4.75 μg/mL，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图4 INH-MTB菌株及其缺失突变菌株异烟肼的MIC差值Fig.4 The difference value of MIC in INH-MTB strain and its deletion mutant strains to isoniazid

3 讨论

在真核生物中，存在一种泛素修饰介导的蛋白质降解机制，可以通过共价键将含有76个氨基酸残基的泛素基团结合到一些折叠不正确或功能缺失的蛋白质上，从而作为一种降解信号让蛋白酶体识别并降解[6]。Pearce等[7]人在原核生物结核杆菌中发现了一种特殊的、被称作Pup的小蛋白，它可以附着到其它蛋白质上决定该蛋白的命运，控制或调节细胞内其他重要的生理过程。

Pearce等[7]发现，在离体条件下，FabD(丙二酰CoA-酰基载体蛋白)和蛋白酶体一起温育，发现FabD未被降解，推测其降解还需要另外一种辅助因子。通过在大肠杆菌中进行细菌双杂交，发现Mpa能和 rv2111c编码的蛋白Pup相互作用，而且这个蛋白质和蛋白酶体的核心蛋白在同一个顺反子中被同时表达，因此推测Pup参与了蛋白质的降解。另外对PafA的突变也导致FabD不能被降解，而它具有一种连接赖氨酸和谷氨酸的连接酶活性，因此推测Pup是通过PafA蛋白连接在目的蛋白上的。同时Striebel等[8]通过质谱结果分析发现，Pup羧基端Gly-Gly-Gln的谷氨酰胺必须经过脱酰胺作用变成谷氨酸，然后才能和目的蛋白上的赖氨酸发生结合，其中脱酰胺酶是Dop，它的缺失导致目的蛋白的大量堆积以及Pup修饰的蛋白质检测不到，因此它的脱酰胺作用是Pup修饰必需的[9]。由此可见，在MTB PPS中Pup需要在辅助因子的作用下标记多种功能蛋白，并介导被标记蛋白通过蛋白酶体降解。

本研究结果显示：（1）rINH-MTB::Dop菌株异烟肼的MIC值与INH-MTB菌株异烟肼的MIC值相比无统计学差异，INH-MTB PPS中Dop基因的过表达对细菌耐药性无影响。可能与Dop蛋白被部分降解以维持MTB PPS的功能稳定有关。Elharar等[10]的研究:检测处于指数生长期的过表达Dop基因的耻垢分支杆菌菌株的mRNA水平，发现与野生型菌株Dop的mRNA水平相比增高7倍。然而，过表达Dop基因的耻垢分枝杆菌其Dop蛋白水平与野生型相比无差异；过表达Dop基因的耻垢分支杆菌对底物的Pup化水平与野生型菌株相比几乎无差异。同时发现低水平的Dop可有效促使Pup化的发生，而高水平的Dop会使Dop的去酰胺化作用和去Pup化作用之间发生失衡，更倾向于促使Pup化的底物发生去Pup化。因此，高水平的Dop会致使Pup化与去Pup化之间无效循环的发生。结果证明低水平的Dop蛋白对维持MTB PPS功能的稳定很重要。

（2）与INH-MTB菌株异烟肼的MIC值相比，INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株异烟肼的MIC值明显降低。由于Dop或PafA的缺失阻断了MTB内底物蛋白的 Pup化过程，造成底物蛋白FabD、PanB等的堆积。其中FabD是结核杆菌分支菌酸合成过程中的重要酶蛋白，但这些折叠不正确或功能缺失蛋白的堆积可能阻碍了正常细胞壁的合成过程，从而提高抗菌药物通过细胞壁的渗透力来影响 MTB的耐药性。Imkamp和 Festa等[9，11]发现Dop基因的敲除、PafA的突变，可以造成底物蛋白的积累，检测不到Pup标记蛋白的存在，Dop和PafA对于Pup与靶蛋白连接是必需的。

（3）与INH-MTB菌株异烟肼的MIC值相比，rINHMTB::Mpa菌株、rINH-MTB::PafA菌株异烟肼的MIC值无明显变化。Mpa是Pup-蛋白酶体系统的辅助因子，在它的辅助作用下可完成对靶蛋白的降解，Mpa可以发生Pup化，最终被蛋白酶体降解。Pup对靶蛋白进行翻译后修饰，不仅使得底物通过蛋白酶体被降解，同时也调节了PPS自身酶的活性[12]。PafA可以通过自身发生ploy-pupylation，以及在Mpa或prcBA缺失的菌株中会出现PafA的累积[13]。由于过表达Mpa基因、过表达PafA基因对INH-MTB菌株异烟肼的MIC值无影响，我们推测结核杆菌有可能通过Pup标记Mpa和PafA蛋白，然后通过蛋白酶体降解以维持PPS的稳定。

（4）与INH-MTB菌株异烟肼的MIC值相比，INHMTB△Mpa菌株、INH-MTB△Pup菌株异烟肼的MIC值明显降低。在结核杆菌泛素样蛋白蛋白酶体通路中Mpa即是底物的受体又可以调节蛋白酶体α亚基“门”的开关。Mpa有助于结核杆菌在宿主体内的生存，Mpa可以使细菌对各种应激行为的耐受性增强，并且在鼠感染模型中缺失Mpa菌株对鼠的毒力明显降低[14]。Pup可能具有两种功能，它不仅使底物成为蛋白酶体识别的标记物，而且使靶蛋白带上无序标签，有利于靶蛋白的降解。我们推测Mpa或Pup的缺失会导致底物蛋白的堆积，使细菌对各种应激行为的耐受性减弱。

（5）Pup基因过表达可提高异烟肼的MIC值。可能是由于Pup蛋白的增多加速了MTB体内有害蛋白的降解速度，使MTB的适应性增强。我们检测了Msm体内Ino1的稳定性，结果显示:对于过表达Pup的野生型Msm其体内的Ino1不能被检测到，这可能是由于体内清除Ino1的速度加快了[15]。

MTB PPS中的Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因可以影响该菌株的耐药表型。提示MTB PPS与INH-MTB菌株的耐药性之间有关联。其中MTB内PPS基因的缺失使菌株耐药性降低的现象或许对结核病的临床治疗具有一定的指导作用。通过抑制MTB PPS中基因的表达或抑制其翻译后的蛋白功能有可能成为结核病治疗的有效靶点。

细菌内药物浓度的平衡需要药物流入和流出系统的共同作用。通过对微生物全基因组序列的分析，已经证实和假定的药物外排泵占所有转运蛋白的6%-18%。其中MmpL7是一个RND家族的转运体。对其功能研究发现，MmpL7蛋白在耻垢分枝杆菌中表达时会使异烟肼的MIC值升高，但在泵抑制剂作用下其MIC值有所降低，这提示MmpL7对结核杆菌的耐药作用是通过将药物外排出菌体实现的。

本实验中所选用的维拉帕米、利血平、氯丙嗪、CCCP，是4种不同类型的已被证实具有外排泵抑制功能的药物。通过刃天青显色法检测到在应用泵抑制剂维拉帕米、利血平、氯丙嗪、CCCP后，INH-MTB菌株，Pup、Dop、PafA和Mpa基因分别缺失突变和过表达的各INH-MTB菌株异烟肼的MIC值会有不同程度的降低，其中以维拉帕米对上述各菌株异烟肼MIC值影响程度最大，利血平、氯丙嗪、CCCP对实验中各菌株MIC值影响程度较小。刃天青显色法检测菌株异烟肼的MIC值，该法存在一定的缺陷，因为药物浓度采用倍比稀释法使有误差时最小为2倍，需要通过多次验证减少误差。研究认为MIC值至少降低4倍才有意义[16]。在这四种外排泵抑制剂中，维拉帕米的抑制作用最强，我们推测可能是由于维拉帕米与外排异烟肼的外排泵具有更高的亲和力。综上所述，我们筛选维拉帕米作为试验中的外排泵抑制剂来分析其对各菌株异烟肼MIC值的影响。

在加用相同剂量、相同浓度的外排泵抑制剂维拉帕米前后，我们将 Pup、Dop、PafA和Mpa基因分别缺失突变的各INH-MTB菌株异烟肼的MIC差值与INH-MTB菌株异烟肼的MIC差值进行了比较。结果提示：上述各菌株异烟肼MIC值的下降与Pup、Dop、PafA、Mpa基因对外排泵功能的调控有关。

本实验提示，MTB PPS与结核杆菌耐药性之间具有相关性，并且MTB PPS可能是通过调控外排泵的功能来影响MTB耐药性。该系统是如何调控外排泵的功能来影响耐药性，目前尚不清楚。MTB中PPS的发现开启了以蛋白质降解的调控为特征的抗结核药物研发的大门，以PPS为靶标的抗结核新药的研发将会为耐药结核病的治疗提供新的有效途径。

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Study on the effect of ubiquitin like protein-proteasome system reacts to the drug-resistance of isoniazid monoresistantMycobacterium tuberculosis

Zhang Shuai1,Wu Fang1,Wu Jiangdong1,Zhang Le1,Zhu Huiyun1,Zhang Dalong2,Wu Qingqing2,Zhang Wanjiang1*
(1 Laboratory for Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases/Center for Collaborative Innovation to Control Highly Infectious Zoonoses in the Western Region of Xinjiang/Department of Pathophysiology,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 Department of ICU,The First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

To explore the effect and mechanism of ubiquitin like protein-proteasome system reacts to the drug-resistance of isoniazid monoresistantMycobacterium tuberculosis.Using the method of resazurin chromogenic,the difference of minimum inhibitory concentration (MIC)of isoniazid were examined among the isoniazid monoresistantMycobacterium tuberculosis(INH-MTB,as a control group)strain,four over-expression genes(Pup,Dop,PafA and Mpa)INH-MTB strains and four same deleted genes (△Pup,△Dop,△PafA and△Mpa)INH-MTB strains.The difference value of MIC of isoniazid were analyzedamong INH-MTB strain,four over-expression genes (Pup,Dop,PafA and Mpa)INH-MTB strains and four same deleted genes (△Pup,△Dop,△PafA and△Mpa)INH-MTB strains.The results showed that the MIC value of isoniazid was 1.03 μg/mL higher in PafA over-expression INH-MTB strain than that in INH-MTB;the MIC value of isoniazid in Dop,Mpa over-expression strains were 1.03 μg/mL and 0.68 μg/mL lower than that in INH-MTB,respectively.The differences had no statistical significance(P>0.05).The MIC value of isoniazid was 8 μg/mL higher in Pup over-expression INH-MTB strain than that in INH-MTB;the MIC value of isoniazid were 4.82ug/ml,4.98 μg/mL,4.99ug/ml and 4.9 μg/mL lower in △Pup,△Dop,△PafA and△Mpa INH-MTB strains than that in INH-MTB,respectively.The differences had statistical significance(P<0.05).After using efflux pump inhibitors,the difference Value of MIC of isoniazid in Pup over-expression INH-MTB strain was 8 μg/mL higher than that in INH-MTB;the difference Value of MIC of isoniazid were 4.65 μg/mL,4.81 μg/mL,4.83 μg/mL,4.75 μg/mL lower in△Pup,△Dop,△PafA and△Mpa INH-MTB strains than that in INH-MTB,respectively.The differences had statistical significance (P<0.05).The difference value of MIC of isoniazid in Dop,PafA,Mpa over-expression INH-MTB strain were 1 μg/mL,0.99 μg/mL,0.65 μg/mL lower than that in INH-MTB,respectively.The differences had no statistical significance(P>0.05).It can be concluded thatMycobacterium tuberculosisubiquitin like protein-proteasome system regulate the development of drug-resistance of INH-MTB strain and may affect its resistance by regulating the function of efflux pumps.

Mycobacterium tuberculosis;ubiquitin like protein-proteasome system;drug-resistance;isoniazid;mechanism

R378.91

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.006

1007-7383(2017)02-0163-06

2016-12-18

国家自然科学基金项目(81260261），石河子大学高层次人才科研启动项目（RCZX201446）

张帅（1989-),女，硕士研究生，专业方向为感染性疾病的病理生理学研究。

*通信作者：张万江（1967-），男，教授，博士生导师，从事感染性疾病的发病机制与防治研究，e-mail:zwj1117@126.com。