响应面法优化PLD-01生产抑菌素发酵条件的研究

张智，王露，尹文哲，李杰

响应面法优化PLD-01生产抑菌素发酵条件的研究

张智1，王露1，尹文哲2，李杰3

（1.东北林业大学林学院，哈尔滨150040；2.哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150086; 3.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）

采用类芽孢杆菌PLD-01发酵生产抑菌素，优化最佳生产条件，为其食品生物防腐剂领域应用奠定基础。在单因素试验基础上，Minitab 15软件数据分析，获得PLD-01产抑菌素最佳培养条件：PLD-01最佳培养基为葡萄糖1%、大豆粉2%、无机盐为KH2PO40.2%；初始pH 7、发酵温度36℃、摇床转速179 r·min-1时，产生抑菌素抑菌效果最佳，此时抑菌圈直径为15.7 mm。

响应面法；类芽孢杆菌；发酵条件；生物防腐剂；抑菌素

为延长食品保质期，化学防腐剂使用普遍，对人体有一定毒副作用。因此，使用安全、高效的生物防腐剂代替化学防腐剂成为研究热点[1]。食品生物防腐剂较多使用Nisin和纳他霉素[2]。类芽孢杆菌作为广谱抑菌活性细菌易于分离培养[3]，产生次生代谢产物能力较强，可分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽类物质，具有较好生物防腐剂作用[4]。

目前，类芽孢杆菌应用于新鲜蔬菜保鲜、工业酶生产和环境保护等领域。刘海燕等发现一株类芽孢杆菌菌株可显著降解微囊藻毒素[5]；陈海英等发现多粘类芽孢杆菌菌株对荔枝霜疫霉菌等真菌有较强抑制效果[6]。Canova等类芽孢杆菌研究发现其产生抗菌物质对立枯丝核菌等有良好抑制效果[7-8]。最适培养基组成和最佳发酵培养条件可使菌数和发酵产物最大化[9]。因此本研究采用响应面法以金黄色葡萄球菌为指示菌，在单因素试验基础上，研究类芽孢杆菌PLD-01菌株生产抗菌素最佳发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 试验菌株

类芽孢杆菌菌株PLD-01由东北林业大学食品科学与工程微生物实验室保存。金黄色葡萄球菌菌株，由黑龙江省科学院微生物所提供。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，酵母浸粉，NaCl均购自上海国药集团化学试剂公司。

1.1.3 主要仪器设备

YXQ-LS-18S手握式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；IS-RSD3台式恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；SWCJ-IFD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ALC-210.1电子天平（北京赛多利仪器系统有限公司）。

1.2 培养基、培养条件

1.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏蛋白胨培养[10]：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.2，121℃灭菌20 mim。培养条件：37℃恒温摇床培养24 h，转速为180 r·min-1。用于活化类芽孢杆菌。

1.2.2 LB培养基

LB培养基：蛋白胨1%，酵母0.5%，NaCl 1%，用于培养金黄色葡萄球菌。

1.3 方法

1.3.1 类芽孢杆菌PLD-01生长曲线绘制

从经37℃活化培养24 h PLD-01菌株斜面挑取一环接种于100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，于37℃震荡培养（180 r·min-1），每隔3 h取样1次，测量OD600值，重复3次，取平均值，确定类芽孢杆菌PLD-01生长曲线。

1.3.2 PLD-01菌株发酵培养

以2%接种量，接入50 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，于30℃、180 r·min-1振荡培养48 h后，将发酵液9 000 r·min-1离心10 min，收集上清液。

1.3.3 PLD-01菌株抑菌活性试验方法

采用纸片法测定类芽孢杆菌抗菌活性。将活化后金黄色葡萄球菌接种于LB培养基，37℃下培养24 h，备用。将直径为6 mm无菌滤纸片浸泡在类芽孢杆菌发酵离心后上清液中。无菌镊子取出后分别贴于金黄色葡萄球菌平板，每个设置3次重复，然后放入37℃培养箱中，倒置培养48 h，观察抑菌情况并测量抑菌圈直径。

1.4 单因素试验

1.4.1 发酵培养基优化

1.4.1.1 碳源种类对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

以液体牛肉膏蛋白胨培养基为基础，选择蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、环糊精、淀粉为碳源替代发酵培养基中牛肉膏[11]，分别制备1%、2%、3%三个浓度单一碳源培养基，再将菌悬液以5%接种量接种到培养基中，置于30℃，180 r·min-1下培养24 h，按照1.3.3抑菌试验，测量抑菌圈直径，确定最佳碳源种类。

1.4.1.2 氮源种类对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

以优化后碳源为基础，选择蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，硫酸铵、大豆粉为氮源，分别制备1%、2%、3%三个浓度单一氮源培养基，再将菌悬液以5%接种量接种到培养基中，置于30℃，180 r·min-1下培养24 h，按照1.3.3抑菌试验，测量抑菌圈直径，确定最佳氮源种类。

1.4.1.3 无机盐种类对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

在确定最佳碳源、氮源种类基础下，选择KH2PO4、CaCl2、MgS04、FeSO4、MnCl2、NaCl等不同无机盐离子添加到培养基中，再将菌悬液以5%接种量接种到培养基中，置于30℃，180 r·min-1下培养24 h，按照1.3.3抑菌试验，测量抑菌圈直径，确定最佳无机盐离子对发酵产抗菌肽影响。

1.4.2 发酵培养条件优化

1.4.2.1 发酵时间对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

在250 mL锥形瓶中分别加入50 mL发酵培养液，将2%菌悬液接种到培养液中，在37℃，摇床转速180 r·min-1下分别培养12、24、36、48、60 h，按照1.3.3抑菌试验方法，观察抑菌情况，测量抑菌圈直径。

1.4.2.2 摇床转速对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

在250 mL锥形瓶中分别加入50 mL发酵培养液，将2%菌悬液接种到培养液中，在37℃，培养时间24 h，分别采用100、140、180、220、260 r·min-1不同摇床转速培养。按照1.3.3抑菌试验方法，观察抑菌情况，测量抑菌圈直径。

1.4.2.3 发酵pH对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

在250 mL锥形瓶中分别加入50 mL发酵培养液，将2%菌悬液接种到培养液中，用HCl和NaOH溶液将培养基pH分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，37℃振荡培养24 h。按照1.3.3抑菌试验方法，观察抑菌情况，测量抑菌圈直径。

1.4.2.4 发酵温度对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

在250 mL锥形瓶中分别加入50 mL发酵培养液，将2%菌悬液接种到培养液中，分别于25、30、35、40、45℃培养箱中振荡培养24 h，按照1.3.3抑菌试验方法，观察抑菌情况，测量抑菌圈直径。

1.4.3 响应曲面优化类芽孢杆菌发酵条件

通过分析影响PLD-01生长因素，确定在单因素条件下适合PLD-01生长摇床转速、发酵pH、发酵温度。Minitab15软件响应面分析优化PLD-01发酵条件，获得PLD-01最佳发酵条件，测量抑菌圈直径，验证响应面分析方法适用性。

1.5 数据分析

采用SPSS 16.0软件作数据统计分析。

2 结果分析

2.1 类芽孢杆菌PLD-01菌株生长曲线绘制

由图1可知，发酵初期，类芽孢杆菌PLD-01繁殖菌体少且生长缓慢。随发酵时间延长，6~21 h繁殖菌体数增加，菌体迅速生长，代谢旺盛，为菌株对数生长期，适合作种子液。21~36 h时为菌株稳定期，PLD-01生长消耗大量培养基中营养物质，有害代谢产物积累，影响菌体生长繁殖速度。36 h后为衰亡期，活菌数量减少。

图1 类芽孢杆菌PLD-01菌株生长曲线Fig.1Growth curve of Paenibacillus PLD-01 strain

2.2 抑菌活性试验结果

结果表明，类芽孢杆菌PLD-01对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，抑菌圈平均直径为12.2 mm。抑菌圈直径与拮抗菌抑菌物质活性、产生量和扩散能力有关，通常抑菌圈直径与拮抗菌抑菌活性成正比[12]。

2.3 最佳培养基筛选

2.3.1 最佳碳源筛选

以牛肉膏蛋白胨液体培养基为基础，研究蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、环糊精、淀粉为碳源对PLD-01产抗菌素影响，每种碳源分别设置1%、2%、3%三个浓度，以抑菌圈直径（mm）作指标，检验抑菌效果，结果见图2。

由图2可知，类芽孢杆菌PLD-01菌株在利用蔗糖和葡萄糖时抑菌圈直径较大，产生较多抗菌素。说明形成产物过程中蔗糖和葡萄糖优于其他碳源，其中葡萄糖浓度为1.0%时，抑菌圈直径最大，说明此时PLD-01菌株有较高产生抗菌素能力，筛选最适碳源为1.0%葡萄糖。高于此浓度，产物合成受到抑制。

图2 不同碳源对PLD-01菌株抑菌效果影响Fig.2Effects of different carbon sources on PLD-01

2.3.2 最佳氮源筛选

以葡萄糖为碳源，研究蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，硫酸铵、大豆粉为氮源对PLD-01产抗菌素影响，每种氮源分别设置1%、2%、3%三个浓度，以抑菌圈直径（mm）作指标，检验抑菌效果，结果见图3。

由图3可知，PLD-01菌株在利用大豆粉和蛋白胨时抑菌圈较大，产生较多抗菌素。其中大豆粉浓度为2.0%时，抑菌圈直径最大，说明此时PLD-01菌株有较高产抗菌素能力，筛选2.0%大豆粉为最适氮源。

2.3.3 最佳无机盐筛选

在以葡萄糖为碳源，大豆粉为氮源基础上，选择KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、NaCl等不同无机盐离子对PLD-01产抗菌素影响，以抑菌圈直径（mm）作指标，检验抑菌效果，结果见图4。

图3 不同氮源对PLD-01菌株抑菌效果影响Fig.3Effects of different nitrogen sources on PLD-01

图4 无机盐种类对PLD-01抑菌效果影响Fig.4Effects of different inorganic salts on PLD-01

由图4可知，当无机盐为KH2PO4时，抑菌圈直径最大，说明影响PLD-01产抗菌素显著因素是KH2PO4，可促进抗菌物质产生，抑菌效果提高显著，其他无机盐无显著效果。选择KH2PO4为最佳无机盐。

最终确定葡萄糖为碳源，大豆粉为氮源，KH2PO4为无机盐。

2.4 发酵条件对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

2.4.1 发酵时间对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

由图5可知，类芽孢杆菌PLD-01在12~60 h均有抑菌圈形成，12 h时，类芽孢杆菌PLD-01抑菌圈直径最小，发酵产抑菌素较少。随发酵时间增加，24 h时抑菌圈直径最大，相对发酵产抑菌素最多。随发酵时间继续延长，消耗培养基中营养物质，有害代谢产物积累，抑菌活性降低。因此，24 h为最优发酵时间。

图5 发酵时间对PLD-01抑菌效果影响Fig.5Effect of fermentation time on PLD-01

2.4.2 摇床转速对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

由图6可知，PLD-01菌株在100~260 r·min-1之间均有抑菌圈产生，转速较小时，空气流通量较小，阻碍菌体生长；转速过大，空气流通量较大，可能引起菌体自溶，活菌量减少。转速为180 r·min-1时抑菌圈直径最大，产生发酵产物最多。因此，最佳摇床转速为180 r·min-1。

2.4.3 发酵起始pH对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

由图7可知，pH 5~9均有抑菌圈产生，PLD-01菌株在pH 5时，抑菌圈较小，说明抑菌活性较弱。在pH 6时，抑菌圈直径增加，抑菌活性增强。在pH 7时，抑菌圈直径最大，说明抑菌活性最大。pH 8~9时，抑菌圈直径减小，抑菌活性减弱。由此说明过酸或过碱环境均影响细菌生长。因此，pH 7为PLD-01最适生长条件。

2.4.4 发酵温度对类芽孢杆菌PLD-01抑菌效果影响

由图8可知，温度在25和45℃时，抑菌圈直径较小，影响菌株生长。温度在30~35℃时，抑菌圈直径增大，35℃时抑菌圈直径最大，35℃为

PLD-01菌株最适生长温度。

图6 摇床转速对PLD-01抑菌效果影响Fig.6Effect of shaker speed on PLD-01

图7 pH对PLD-01抑菌效果影响Fig.7Effect of pH on PLD-01

图8 温度对PLD-01抑菌效果影响Fig.8Effect of temperature on PLD-01

通过以上试验获得类芽孢杆菌PLD-01产抗菌素最适宜发酵条件为：发酵时间24 h、摇床转速180 r·min-1、发酵pH 7、发酵温度35℃。

2.5 响应面优化类芽孢杆菌PLD-01发酵条件

2.5.1 响应面分析方案与试验结果

根据Box-Behnken中心组合设计原理，设计摇床转速、pH、温度设计3因素3水平共15个试验点作响应面分析（见表1），在中心值重复3次试验，分析方案及试验结果见表2。

2.5.2 模型建立以及统计分析

利用Minitab15软件对表2数据二次多元回归拟合，获得抑菌圈直径值对编码自变量A、B、C二次多项回归方程：

Y=15.8000+0.10000A+0.350000B+0.40000C-1.85000A2-0.75000B2-1.25000C2-0.770000AB+ 0.300000AC-0.600000BC（1）

对回归模型（1）方差分析（见表3），结果表明，模型极显著（P<0.01）。回归模型R-Sq=98.44%，决定系数为0.9844，说明该模型可解释98.44%变化。因此模型可分析和预测PLD-01不同条件下生长情况。

由表4可知，一次项中影响极显著因素为C，显著因素为B。二次项A2、B2、C2和AB、BC均为显著影响因子。其他项不显著，说明起始pH和摇床转速对类芽孢杆菌PLD-01影响较大。在所选各因素水平范围内，按照对结果影响排序C>B>A，即发酵温度>起始pH>摇床转速。3个因素中，摇床转速和起始pH、温度和起始pH间存在较显著交互作用。失拟项F值为2.17，不显著。

根据回归方程各项方差分析（见表3），由于失拟项误差较小，方程拟合情况良好，可用该回归方程代替试验真实点分析和预测结果。

表2 响应面分析方案与试验结果Table 2Response surface analysis program and test results

表3 回归模型方差分析Table 3Analysis of Variance in Regression Model

表4 回归方程系数和显著性试验结果Table 4Regression equation coefficients and significance test results

2.5.3 等值线图和响应分析

利用Minnitab15软件对表2数据作二次多元回归拟合，获得二次回归方程响应面（见图9~11）。可见，温度与pH、pH与摇床转速对PLD-01抑菌效果交互作用显著，而温度与摇床转速对PLD-01抑菌效果交互作用不显著。

利用Minitab 15软件，通过BOX-Behnken试验结果分析，确立摇床转速，起始pH，温度3个影响因素优化点（A、B、C）即（179.19、7.38、36.11）此时Y值取最大值15.86，复合合意性达到96.2%（见图12）。

2.5.4 验证试验

通过响应面分析获得PLD-01最佳培养条件，做3次平行试验，验证试验结果。获得抑菌圈直径为15.7 mm，与预测15.8 mm基本相符，证实响应面分析法可靠。

图9 温度与起始pH交互作用对PLD-01抑菌效果影响Fig.9Effect of temperature and initial pH on PLD-01

图10 摇床转速与温度交互作用对PLD-01抑菌效果影响Fig.10Effect of shaker speed and temperature on PLD-01

图11 摇床转与起始pH交互作用对PLD-01抑菌效果影响Fig.11Effect of shaker speed and initial pH on PLD-01

图12 最佳优化条件Fig.12Best condition

3 结果与讨论

类芽孢杆菌作为生物防腐剂，产生抑菌物质，培养基组成及适宜发酵条件影响抑菌圈直径，即产生抗菌素量。培养基优化单因素试验中，确定1%葡萄糖为碳源，2%大豆粉为氮源，KH2PO4为无机盐，此时抑菌圈平均直径为14.5 mm，优化前平均直径12.2 mm，结果较优化前提高1.19倍。而文凤云等优化后培养基组成为蛋白胨、酵母浸出粉，MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O为无机盐，预测抑菌圈直径为13.3 mm[13]。可能因为大豆粉作为氮源时利于抗菌物质合成，优于蛋白胨。因此确定最佳培养基为1%葡萄糖，2%大豆粉，KH2PO4为无机盐。在培养条件优化单因素试验中，pH 7抑菌效果最佳，与林茂兹等研究多粘类芽孢杆菌抑菌效果结果一致[14]。pH过高或过低均不利于抗菌素产生，影响抑菌效果。摇床转速在180 r·min-1时抑菌效果较好，与陈小煌等对类芽孢杆菌培养条件优化结果基本一致[15]，说明此时溶氧量利于产生抗菌物质。温度为35℃时抑菌效果较好，与程爱芳在优化多粘类芽孢杆菌产纤维素酶条件结果一致[16]，说明35℃适宜类芽孢杆菌菌体生长，可以产生较多抗菌物质。

综上所述，类芽孢杆菌PLD-01生长适应性较强，优化后抑菌圈直径是优化前1.3倍，达到预期效果。根据单因素试验，获得最佳培养基配方为大豆粉2%，葡萄糖1%，无机盐为KH2PO4。综合考虑摇床转速、pH、温度3个主要因素对菌体生长影响，采用响应面分析方法，根据Box-Behnken中心组合设计原理处理试验数据，得到菌体生长模型，模型各因素最优水平以及最佳条件发酵条件。试验结果表明，类芽孢杆菌PLD-01最佳培养条件为：温度为36℃、发酵液pH 7、摇床转速179 r·min-1。虽然类芽孢杆菌不同菌株最佳生长条件存在差异，但优化PLD-01生长条件对其他菌株具有参考价值。

[1]谢俊杰,佘世望.食品防腐新领域——微生物天然防腐剂[J].食品科学,1999,20(1):13-14.

[2]Davies E A,Milne C F,Bevis H E,et al.Effective use of nisin to control lactic acid bacterial spoilage in vacuum-packed bolognatype sausage[J].Journal of Food Protection,1999,62(9):1004-1010.

[3]王智文,袁士涛,何亮,等.多粘类芽孢杆菌Cp-S316抗真菌活性物质的提取及其部分性质研究[J].农业环境科学学报, 2007,26(4):1464-1468.

[4]杨少波,刘训理.多粘类芽孢杆菌及其产生的生物活性物质研究进展[J].微生物学通报,2008,35(10):1621-1625.

[5]刘海燕,宦海琳,汪育文,等.微囊藻毒素降解菌S3的分子鉴定及其降解毒素的研究[J].环境科学学报,2007,27(7): 1145-1150.

[6]陈海英,林健荣,廖富蘋,等.多粘类芽孢杆菌CP7对荔枝霜疫霉菌的抗菌活性及其作用机制[J].园艺学报,2010,37(7): 1047-1056.

[7]Canova S P,Petta T,Reyes L F,et al.Characterization of lipopep⁃tides from Paenibacillus sp.(IIRAC30)suppressing Rhizoctonia solani[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010,26(12):2241-2247.

[8]Chung Y R,Kim C H,Hwang I,et al.Paenibacillus koreensis sp. nov.,a new species that produces an iturin-like antifungal com⁃pound[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2000,50(4):1495-1500.

[9]张淑梅,王玉霞,孟利强,等.内生解淀粉芽孢杆菌TF28液体发酵条件研究[J].东北农业大学学报,2013,44(11):19-24.

[10]郝林.食品微生物学实验技术[M].北京:中国农业出版社, 2001.

[11]陈静,何连芳,张玉苍.嗜酸乳杆菌产细菌素培养基及培养条件的优化[J].中国酿造,2010(12):75-79.

[12]田祖光.棉花黄萎病拮抗细菌12-34菌株的分离鉴定及抗菌蛋白纯化[D].保定:河北农业大学,2009.

[13]文凤云,王国永,李晓丽,等.多粘芽孢杆菌Dw-6菌株培养条件的优化及其发酵液抑菌活性的初步研究[J].西北农业学报, 2011,20(4):30-34.

[14]林茂兹,金美芳,邹虹.多粘类芽孢杆菌S960菌株发酵条件优化[J].福建师大福清分校学报,2015(5):6-11.

[15]陈小煌,李自然,黄小云,等.多粘类芽孢杆菌培养条件优化研究[J].福州大学学报:自然科学版,2013(5):947-954.

[16]程爱芳,邓政东,陈文,等.多粘类芽孢杆菌HD-1产纤维素酶的条件优化[J].食品工业科技,2015,36(10):173-177.

PaenibacillusPLD-01 was used to ferment to produce antibiotics,and optimized its optimal production conditions,the aim is to apply antibiotics to the field of food preservatives.On the basis of single factor test,use Minitab 15 software for data analysis and mapping,obtained optimal medium composition and optimal culture conditions ofPLD-01:the best medium forPLD-01 was 1% glucose,2%soybean meal,0.2%KH2PO4as inorganic salt.At the initial pH 7,the fermentation temperature was 36℃and the shaking speed was 179 r·min-1,the bacteriostatic effect was the best, and the diameter of the inhibition zone was 15.7 mm.

response surface methodology;paenibacillus;fermentation;biological preservatives; ablastin

TS201.3

A

1005-9369（2017）06-0033-10

时间2017-6-26 17:42:14[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170626.1742.022.html

Optimization ofPLD-01 producing antibiotics fermentation conditions

by response surface methodology/ZHANG Zhi1,WANG Lu1,YIN Wenzhe2,LI Jie3

(1.School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.The Second Affiliated Hospital,Harbin Medical university,Harbin 150086,China;3.School of Life Sciences, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

2017-04-07

黑龙江省应用技术研究与开发计划重大项目（GA15B203）

张智（1964-），女，教授，博士生导师，研究方向发酵工业、功能食品。E-mail:ldzhangzhi@163.com

张智,王露,尹文哲,等.响应面法优化PLD-01生产抑菌素发酵条件的研究[J].东北农业大学学报,2017,48(6):33-42.

Zhang Zhi,Wang Lu,Yin Wenzhe,et al.Optimization ofPLD-01 producing antibiotics fermentation conditions by response surface methodology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(6):33-42.(in Chinese with English abstract)