健脾补肺化痰方对幼龄哮喘大鼠肺组织形态学光镜下的影响

余燕玲+边逊+尚莉丽+田净忆

摘要：目的 研究健脾補肺化痰方对幼龄哮喘大鼠肺组织形态学光镜下的影响。方法 取清洁级幼龄雄性SD大鼠120只（体重控制95±5 g），随机分为正常组：4 w、8 w、12 w，模型组：4 w、8 w、12 w，健脾补肺化痰方中药组（简称中药组）：4 w、8 w、12 w及地塞米松西药组（简称西药组）：4 w、8 w、12 w，共12组，每组10只。采用第1 d及第8 d腹腔注射OVA（100mg）+Al（OH）3凝胶（100 mg）混合液1 ml/鼠致敏，第15 d卵蛋白溶液雾化激发哮喘，第16 d开始分别给予不同药物治疗，按时间节点不同，各组分别按照4 w、8 w、12 w后处死大鼠，HE染色后光镜下观察各组的肺组织形态学的情况。结果 正常组大鼠肺组织HE病理变化不明显，模型组肺组织切片显示支气管管腔狭窄，黏膜上皮破损及黏膜下胶原沉积，基底膜明显增厚且不规则，支气管管壁各层均有炎性细胞浸润，随激发时间的越长越明显；健脾补肺化痰方4 w组的大鼠支气管壁周围有少量EOS、淋巴细胞浸润、气道平滑肌增厚稍增厚，伴粘液分泌，基底膜稍增厚；健脾补肺化痰方12 w组与8 w组相比，气道平滑肌相对增厚，管腔相对狭窄。地塞米松组肺组HE病理改变与模型组相比较明显减轻，但未完全消失。

结论 健脾补肺化痰方能抑制炎症反应，降低气道高反应性，有效防治气道重塑。

关键词：小儿哮喘；幼龄大鼠；肺组织形态

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）14-0050-03

Effect of Jianpi Bufei Huatan Decoction on Morphology of Lung Tissue in Young Asthmatic Rats

YU Yan-ling1，BIAN Xun1，SHANG Li-li2，TIAN Jing-yi3

（1.Nanjing Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210014，Jiangsu，China；

2.Anhui Traditional Chinese Medicine Hospital，First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，Anhui，China）

Abstract：Objective To study the effects of Jianpi Huatan Decoction on pulmonary morphology under light microscopy of lung tissue of young rats with asthma.Methods The clean level of young male 120 SD rats（weight control 95±5 g），were randomly divided into normal group：4w，8w，12w，model group：4w，8w，12w，Jianpi Bufei Huatan formula of Chinese medicine group（traditional Chinese medicine group）：4w，8w，12w，and dexamethasone in western medicine group（referred to as the western medicine group）：4w，8w，12w，a total of 12 groups，10 rats in each group.1 ml/rats were sensitized by intraperitoneal injection of OVA（100mg）Al（OH）3 gel（100 mg）intraperitoneally for first and 8 days，the fifteenth d ova inhalation asthma， the sixteenth d were given different drugs， according to different time，they were in accordance with the 4w， 8w，12 w，the rats were killed after treatment，HE staining of lung tissue morphology observed under light microscope.Results In the normal group，the lung tissue of HE rats without pathological changes obviously， the model group lung tissue sections showed bronchial stenosis，collagen deposition and submucosal epithelial damage，basement membrane thickened and irregular bronchial wall layers were inflammatory cell infiltration，the excitation with the longer the more obvious；Jianpi Bufei Huatan formula with a small amount of EOS，around 4w group of bronchial wall rat lymphocyte infiltration，airway smooth muscle thickening slightly thickened，with mucus secretion，basement membrane thickening slightly；Jianpi Bufei Huatan formula 12w group compared with 8w，the relative airway smooth muscle thickening，lumen is relatively narrow.Dexamethasone group HE pathological changes compared with the model group was significantly reduced，but not completely disappear.Conclusion Jianpi Bufei Huatan Decoction can inhibit the inflammatory reaction，reduce airway hyperresponsiveness，and effectively prevent airway remodeling.

Key words：Pediatric asthma；Young rats；Lung tissue morphology

最新的儿童哮喘国际共识将哮喘定义简化为哮喘是与多变的气流阻塞和支气管高反应性相关的慢性炎症病变，症状表现为反复发作的喘息、咳嗽、气促和胸闷[1]。有学者通过整理我国近30年关于儿童哮喘的流行病学文献和研究发现，0～14岁儿童哮喘患病率呈上升趋势，且造成这种上升趋势的原因与空气质量、生活条件和医疗条件关系密切[2]。因此，儿童哮喘的防治刻不容缓。健脾补肺化痰方是导师多年来用于防治儿童支气管哮喘的经验方，本课题通过实验研究观察该方对幼龄哮喘大鼠的肺组织形态学光镜下的影响，探讨健脾补肺化痰方通过干预哮喘患儿气道重塑发生的作用机理，进一步验证该方对哮喘治疗的有效性。

1材料与方法

1.1实验材料

120只清洁级雄性幼龄大鼠（体重95±5g），由安徽中医药大学实验动物中心提供。主要试剂及药品：卵白蛋白（OVA），生理盐水，3%戊巴比妥；健脾补肺化痰方由南京市中西医结合医院提供。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 取清洁级幼龄雄性SD大鼠120只（体重控制95±5 g），由安徽中医药大学实验动物中心提供。随机分为正常组：4 w、8 w、12 w，模型组：4 w、8 w、12 w，健脾补肺化痰方中药组（简称中药组）：4 w、8 w、12 w及地塞米松西药组（简称西药组）：4 w、8 w、12 w，共12组，每组10只。

1.2.2实验方法 参照参考文献 [3]复制大鼠哮喘模型，哮喘各组分别在第1 d和第8 d腹腔注射OVA（100mg）+Al（OH）3 （100 mg）混合液1 ml/鼠致敏，第15 d起以1%OVA雾化激发，30 min/次，并隔天1次，以大鼠出现呼吸急促，腹肌抽搐，口唇发绀、站立不稳代表模型复制成功。正常组参照上述方法，只是致敏与激发时均以生理盐水代替致敏液。同时，Z4、M4、J4、D4组雾化激发4 w，Z8、M8、J8、D8组雾化激发8 w，Z12、M12、J12、D12组雾化激发12 w。给药剂量参考魏伟主编的《药理实验方法学》[4]列出人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值。造模后第16 d开始给药，健脾补肺化痰方、地塞米松给药剂量取中等剂量，相当于成人日常治疗量的5倍，灌胃给药（容积为25 ml/kg），正常组、模型組灌胃等体积的9.0 g/L氯化钠溶液，1次/d，每组中再分别对应连续灌胃4 w、8 w、12 w。各组大鼠分别于雾化吸入的第4 w、8 w、12 w，最后一雾化激发24 h内，用2%戊巴比妥（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉后处死，打开胸腔，取靠近右肺门处切取肺组织100 mg（大小约3 mm×3 mm×3 mm），浸入4%多聚甲醛中固定4～6 h，转入70%乙醇，送病理科进行石蜡包埋。取石蜡包埋后的组织块常规切片（厚度约为4 μm）用于染色。60 ℃恒温烤箱中烤片，熔蜡1 h；二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各15 min；先后放入100%酒精Ⅰ5 min/ Ⅱ2 min，90%酒精2 min，80%酒精2 min，70%酒精2 min脱水；后用蒸馏水冲洗2 min；将细胞核苏木精染色15 min左右染成蓝色后自来水洗去浮色；分色数秒；用自来水冲洗15～20 min左右蓝化；细胞质伊红染色2 min左右成红色；分色： 镜下控制95%酒精分色1 min；先后放入95%酒精5 min，100%酒精110 min，100%酒精210 min脱水；入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min透明；用中性树胶封片后显微镜下观察。

1.3 统计学方法

应用SPSS19.0软件行单因素方差分析及相关性分析，所有计量资料实验数据以（x±s）表示，P<0.05为具有显著性差异；P<0.01为具有非常显著性差异。

2结果

正常组大鼠肺组织HE病理变化不明显，支气管管腔规则，黏膜上皮及黏膜肌层完整，气管平滑肌未见增厚，周围无炎性细胞浸润，肺泡形态较规则；模型组肺组织切片显示支气管管腔狭窄，黏膜上皮破损及黏膜下胶原沉积，基底膜明显增厚且不规则，支气管管壁各层均有嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润，部分管腔内可见黏液栓且肺泡结构紊乱，随激发时间的不断延长，模型组大鼠可见支气管壁明显增厚，基底膜明显增厚且不规则，支气管平滑肌肥大加重，管腔狭窄明显等；健脾补肺化痰方4 w组的大鼠支气管壁周围有少量EOS、淋巴细胞浸润、气道平滑肌增厚稍增厚，伴粘液分泌，基底膜稍增厚；健脾补肺化痰方12 w组与8 w组相比，气道平滑肌相对增厚，管腔相对狭窄。地塞米松组肺组HE病理改变与模型组相比较明显减轻，但未完全消失。光镜下观察哮喘各组大鼠肺组织HE图像，见图1。

3讨论

1922年Huber和Koessler首先提出“气道重塑”的概念，他们发现死亡的哮喘患者的气道腔会出现严重狭窄，并伴有粘膜肥厚、气道壁增厚及炎症细胞的浸润等。近年来，许多病理学和形态学的研究证实哮喘患者气道结构的变化不仅存在于重型哮喘中，而轻型哮喘中也存在不同程度的上述的病理改变，气道结构一系列的改变，尤其是气道壁的增厚导致气道高反应性增加，同时改变平滑肌收缩的程度使管腔进一步狭窄，另外上皮下胶原的沉积使气道壁粘膜的僵硬度较外侧的增加[5]。

气道重塑是哮喘的主要病理学特征之一，也是哮喘迁延难愈的重要环节。到目前为止，关于气道重塑都认为是由多种炎性细胞和细胞组分参与的气道损伤修复且反复刺激的过程。中医治疗哮喘应遵循“急则治标，缓则治本”的原则，多靶点、多途径的整体治疗引起哮喘的气道慢性炎症，且降低AHR具有明显优势。哮喘发生时，机体内各种炎性细胞、细胞因子、炎症介质相互作用及免疫调节的紊乱使其处于高反应状态，气道局部则发生相关病理改变。现在有研究表明，麻芍平喘汤可抑制IL-5、IL-13活性，均有抑制炎细胞浸润，缓解大鼠气道炎症，修复破坏的气道结构，从而改善气道重塑[6]；补肺益肾方可减少哮喘豚鼠肺内IL-5含量，降低EOS活性，加速EOS凋亡，从而减轻气道炎症，抑制气道重塑[7]；小青龙汤能有效降低TGF-β1Smad蛋白在哮喘大鼠肺组织中的表达，延缓气道重塑[8]。

依据“急则治标，缓则治本”的原则，在发作期攻邪治标，祛痰降气，缓解期扶正固本。治喘治标不难，但哮除根不易，若仅仅满足发作期的治疗，易致哮喘的反复发作而得不到有效控制，所以控制哮喘的关键是要抓住缓解期的治疗。小儿生理特点为“肺常不足”，“脾常虚”，而处在生长发育阶段的小儿肾气在不断充实，故肾虚者少见，治疗侧重健脾且益肺。根据“培土生金”及“治痰先治气”理论，并与现代药理研究成果，结合多年的临床实践，研制出健脾补肺化痰方，该方具有健脾肺气、化痰之功效。本实验研究该方能减轻BA大鼠的支气管壁炎症，减轻气道壁的增厚及纤维化，降低气道高反应性，有效防治气道重塑。

参考文献：

[1]向莉.解读2012年儿童哮喘国际共识[J].中华实用儿科临床杂志，2014，29（1）：77-79.

[2]金岩，张丽颖.国内儿童哮喘流行病学调查的回归分析[J].中华中医药学刊，2012，30（6），35-37.

[3]李昌崇，苏苗赏，林立，等.地塞米松对年幼期哮喘大鼠气道Toll样受体4信号转导的调节机制[J].中华儿科杂志，2006，44（12）：937-940.

[4]魏伟，吴希美，李元建.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社， 2010：1698.

[5]Puddicombe SM，Polosa R，RichterA，et al.Involvement of the epidermal growth factor receptor in epithelial repair in asthma[J].FASEB J，2000，14（10）：1362-1374.

[6]王明明.汪受传教授治疗小儿哮喘临床经验[J].中国中医药现代远程教育，2014，12（18）：26 -28.

[7]杨晓琨，陈宇昕.肾络宁对FSGS肾病大鼠胸主动脉的重构作用[J].辽宁中医杂志，2014，41 （11）：2490.

[8]杨帆，易桂生.小青龙汤对哮喘大鼠TGF-β1/Smda3信号通路的影响[J].河南中医，2014，36 （4）：1041-1043.

编辑/李桦