抗HBsAg抗体在乙型肝炎相关疾病中的应用进展

杨玥+刘煜

摘要：乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的包膜蛋白，其含量可以反映病毒活性，常用于临床相关疾病的诊断。由于基因整合的原因，HBsAg在大部分HBV相关疾病中高表达，被认为是重要的靶标。针对此靶点的抗HBsAg抗体已被广泛应用HBV相关疾病的分子诊断及治疗领域。

关键词：乙型肝炎；抗乙型肝炎表面抗原抗体；病毒活性；应用

中图分类号：R392 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）14-0028-03

乙型肝炎是由HBV引起的感染性疾病，尽管疫苗能够成功减少HBV感染的人数，但仍有超过20亿人受到HBV的困扰。持久的HBV感染会引起慢性肝炎，进而诱发肝硬化和肝癌等高致死性疾病。目前临床上的治疗方法主要是使用干扰素和抗逆转录试剂，但长期使用并不能彻底清除病毒，获得较好的临床受益，反而还会产生耐药的突变病毒株。因此，研究者需继续探索HBV的致病机制以及开发新的药物。HBsAg是HBV的包膜蛋白，在病毒附着、侵入肝细胞的过程中发挥重要的作用；也是宿主体液和细胞免疫反应的靶点，可以诱导机体产生长期的保护性免疫，接种疫苗和HBV感染后会产生特异性抗HBsAg抗体。研究者利用抗HBsAg抗体研究HBsAg的复杂结构，绘制蛋白的空间构象，结合位点等，用于临床检测诊断试剂的开发以及设计合成、改构针对HBsAg的高效价的特异性亲和抗体。

1 抗HBsAg抗体在诊断方面的应用

早期诊断是治疗成功的关键，精确的诊断试剂对于疾病的发展控制至关重要。HBsAg在HBV感染肝细胞后大量分泌，其表达水平可以反映HBV cccDNA的转录活性，配合反映病毒复制活性的HBV DNA水平对患者进行诊断。检测HBsAg的方法大多以抗原抗体特异性反应为基础。

HBsAg诊断试剂诞生于1992年，用于减少输血时发生的HBV感染应运而生。随着检测试剂灵敏度、准确度的不断发展，其用途也日益增多，如今常用于临床检测HBsAg的水平及变化判断患者临床状态及治疗效果[1]。HBsAg的持续表达会刺激肝细胞增生，对肝细胞癌（HCC）的形成及发展起着重要的作用。尤其是在肝硬化的患者中，肝细胞增殖速率的快速升高是导致HCC的危险因素。Chen Y C[2]等发现HBsAg血清转换的患者有较好的临床预后，较少发展為HCC。因此，监测HBsAg的水平变化是必不可少的。

目前临床上检测HBsAg的方法是以抗HBsAg抗体捕获样本中HBsAg的能力为基础，利用抗原抗体特异性反应的原理形成的，常用ELISA法、时间分辨荧光分析法、化学发光免疫分析法等，并且很多已商品化，如雅培Architect系统、罗氏Elecsys系统等。研究者为了提高灵敏度和精确度，不断寻找新的方法。Alizadeh N等[3]发明以抗HBsAg抗体为基础，利用高灵敏度的电化学免疫传感器检测HBsAg的方法。Sangkyu Lee等[4]建立了压电微悬臂传感器检测方法，通过免疫反应后将生物信号转化至电信号，检测HBsAg的精确度可达0.1～100 ng/ml，并且装备具有小巧、可携带、可多通量检测等优点。此外，抗HBsAg抗体本身也可作为临床指标，如可以通过疫苗接种后检测血样中抗体滴度判断免疫效果，也可与HBsAg水平共同判断患者状态给予更准确的诊治方案。由此可见，抗HBsAg抗体是HBV相关疾病诊断的基础。

2 抗HBsAg抗体在治疗方面的应用

抗体由于具有中和作用，固有效应、刺激免疫系统等多种功能已成功用于肿瘤、自身免疫等疾病的治疗，但很少用于慢性病毒感染。近年来，抗体在获得性免疫缺陷综合征、埃博拉等疾病的研究中也崭露头角。虽然目前尚未明确其分子机制，但是利用抗体介导的免疫疗法可作为治疗病毒感染性疾病的候选方法。抗体通过结合作用使病毒包膜蛋白失活，阻断病毒入侵从而抑制感染的传播；也可以通过固有效应功能如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、补体裂解、吞噬作用等清除循环中的病毒、病毒抗原、产病毒细胞等；此外，抗体与病毒的复合物可以通过Fc段与免疫效应细胞作用产生多种固有和获得性免疫效应对抗病毒。更重要的是，临床上将HBsAg的血清转换作为是抗HBV治愈的关键指标，然而目前的药物很少能实现这一目标。

2.1中和作用

乙型肝炎人免疫球蛋白（HBIG）是临床上常用的阻断HBV感染的被动免疫试剂，通常从自然感染或接受疫苗后产生高效价抗HBsAg抗体的健康人血浆中获取，经低温乙醇蛋白分离法等生物浓缩工艺制得。HBIG可使人体被动接受高效价抗HBsAg抗体，从而中和、清除血液中游离的的HBV，避免感染的发生。Tsuge M等[5]发现HBIG可在人肝嵌合鼠模型中显著减少HBV DNA的含量，并呈剂量依赖的形式，且在给药24 h后血清HBsAg的含量便低于检测限。因此，HBIG可用于治疗HBV相关疾病。但是HBIG作为一种血液制品，由于原材料和质量的严格控制等原因很难大规模生产，同时HBIG也有血液制品含有其它传染性病原体风险的共同的隐患。为了解决这一壁垒，科学家们希望应用杂交瘤和噬菌体库等技术生产安全、有效的抗体。

Zhang T Y等发现靶向HBsAg（GPCK（R）TCT）结合位点的抗体E6F6比结合其它表位的抗体对HBV具有更有效、更持久的作用[6]，证实其在动物模型中可以促进HBsAg和病原体的清除、阻止病毒初始感染。Kucinskaite-Kodze I等[7]也筛选出针对同一位点的高亲和力的HB1抗体，证实其与抗体E6F6具有相同的活性。Tan W等[8]构建的针对HBsAg两个不同表位的双特异性抗体C4D2-BsAb，不仅能更好的中和HBV，还可被内吞进入肝细胞抑制HBsAg的分泌。研究者对于抗HBsAg抗体的开发及作用机制的逐渐认识有助于我们更好的了解HBV，更快的研发出新的有效的抗HBV相关疾病的药物及疗法。本实验室也通过杂交瘤方法筛选出具有高亲和力的抗HBsAg抗体，经体外实验证实其可以特异性靶向结合表达HBsAg的肝癌细胞，抑制细胞分泌HBsAg，促进细胞凋亡，具体作用机制有待进一步探索。

2.2靶向作用

肿瘤靶向治疗在HER-2过表达的乳腺癌、胃癌等领域都取得了巨大的发展。HBV相关疾病如慢性乙型肝炎及其诱导的肝硬化、肝癌患者的基因组中会发生HBV DNA整合[9]，使HBsAg稳定的过表达。因此，HBsAg可作为特异性标记物进行靶向治疗。利用抗HBsAg抗体作为运输工具，通过融合蛋白或化学偶联等方式将一些小分子药物、多肽、核酸、放射性核素等具有杀伤肿瘤作用或检测相关的物质递送至肝细胞癌处发挥作用，而其中由于单链抗体具有分子量小，免疫原性低、表达构建方法成熟、组织渗透性好等优势被研究者们广泛使用。Bo Yan等[10]利用靶向HBsAg的单链抗体scFv15作为“子弹头”携带Fdt-HA2-tBid到达HBsAg阳性的HCC细胞中，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。Wen等[11]通过构建靶向HBsAg的单链抗体与鱼精蛋白截短体的融合蛋白，成功递送SiRNA至HBsAg为阳性的HepG2.2.15细胞中有效抑制 HBV DNA的表达和复制。这些研究均证实抗HBsAg抗体作为靶向工具治疗HBV相关肝部疾病的潜力。

2.3免疫激活作用

免疫反应是宿主清除体内细菌、病毒及肿瘤细胞等病原物质的重要手段。长期感染HBV患者机体免疫反应受到明显抑制，主要表现为CD4+T细胞、CD8+T细胞数量明显下降，Treg细胞数量明显升高，且T细胞表面免疫抑制相关类受体如PD-1、CTLA-4、TIM-3等呈高表达，T细胞功能严重丧失[12]。研究表明，HBsAg可以严重影响骨髓来源的树突状细胞功能，进而抑制T细胞的增殖，降低INF-γ及IL-12等细胞因子的分泌[13]；也可以有效减弱Toll样受体所介导的抗病毒反应[14]；高水平HBsAg会耗尽HBsAg特异性T细胞反应，被认为是慢性乙肝病人产生病毒免疫耐受的一个重要因素。

抗HBsAg抗体可以大幅度减少HBsAg水平，给免疫系统清除病毒提供机会，这是目前其他药物所不具备的能力。Tharinger H等[15]利用抗HBsAg抗体与HBsAg结合形成复合物的能力，可以加快机体外周白细胞对HBsAg的吞噬作用。由于CHB患者与正常人血样吞噬HBsAg：IC复合物的能力相当，HBsAg持续暴露并不会改变CHB患者外周白细胞的吞噬能力，因此可以通过注射外源性抗HBsAg抗体增强吞噬作用。Zhu D等[16]证明循环中HBsAg的水平和持續时间是导致免疫耐受的主要原因。抗HBsAg抗体可减少循环HBsAg的含量，使耐受鼠逐渐恢复B细胞和CD4+T细胞的反应，打破耐受。同时前文提到Zhang T Y等人[6]筛选出靶向HBsAg的抗体E6F6在动物模型中可以调节免疫作用，恢复HBV耐受鼠的抗HBV T细胞响应。这些证据均证实抗HBsAg抗体在恢复HBV相关疾病的免疫反应方面具有良好的潜力。

3 展望

越来越多的证据表明HBsAg在HBV相关疾病中扮演重要的角色，抗HBsAg抗体逐渐受到研究者的重视。抗体的更新发展可以使诊断试剂精确及时的确诊疾病，辅助用药方案，为临床预后给予参考；可以代替HBIG解决因来源导致的价格昂贵、产品紧俏以及血液制品固有的病原体风险等问题，用于中和HBV，阻断病毒感染；可以利用抗HBsAg抗体的靶向性递送小分子、基因、蛋白等药物，或让药物与免疫系统相互作用，增加疗效减少副作用。因此，坚信在未来抗HBsAg抗体在HBV相关肝部疾病的诊断检测和临床治疗等领域会有更广泛的应用。

参考文献：

[1]Moriyama K，Isomura M.Development of Highly Sensitive Quantitative HBsAg Reagent and Its Availability][J].Rinsho Byori the Japanese Journal of Clinical Pathology，2015，63（1）：44-52.

[2]Chen Y C，Jeng W J，Chien R N，et al.Clinical outcomes after spontaneous and nucleos（t）ide analogue‐treated HBsAg seroclearance in chronic HBV infection[J].Alimentary pharmacology &therapeutics，2016，43（12）：1311-1318.

[3]Alizadeh N，Hallaj R，Salimi A.A highly sensitive electrochemical immunosensor for hepatitis B virus surface antigen detection based on Hemin G-quadruplex horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme-signal amplification[J].Biosensors and Bioelectronics，2017，94：184-192.

[4]Lee S，Cho J，Lee Y，et al.Measurement of Hepatitis B Surface Antigen Concentrations Using a Piezoelectric Microcantilever as a Mass Sensor[J].Journal of Sensors，2012，201（1687-725X）：276-283.

[5]Tsuge M，Hiraga N，Uchida T，et al.Antiviral effects of anti-HBs immunoglobulin and vaccine on HBs antigen seroclearance for chronic hepatitis B infection[J].Journal of Gastroenterology， 2016，51（11）：1073-1080.

[6]Zhang T Y，Yuan Q，Zhao J H，et al.Prolonged suppression of HBV in mice by a novel antibody that targets a unique epitope on hepatitis B surface antigen[J].Gut，2015，65（4）：658-671.

[7]Kucinskaite-Kodze I，Pleckaityte M，Bremer C M，et al.New broadly reactive neutralizing antibodies against hepatitis B virus surface antigen[J].Virus Research，2015，211：209-221.

[8]Tan W，Meng Y，Li H，et al.A bispecific antibody against two different epitopes on hepatitis B surface antigen has potent hepatitis B virus neutralizing activity[J].Mabs，2012，5（6）：946-955.

[9]Saitta C，Tripodi G，Barbera A，et al.Hepatitis B virus （HBV） DNA integration in patients with occult HBV infection and hepatocellular carcinoma[J].Liver International，2015，35（10）：2311-2317.

[10]Yan B，Ouyang Q，Zhao Z，et al.Potent killing of HBV-related hepatocellular carcinoma by a chimeric protein of anti-HBsAg single-chain antibody and truncated Bid[J].Biomaterials， 2013，34（20）：4880-4889.

[11]Wen WH，Liu JY，Qin WJ，et al.Targeted inhibition of HBV gene expression by single-chain antibody mediated small interfering RNA delivery[J].Hepatology，2007，46（1）：84-94.

[12]Carlo F.HBV and the immune response[J].Liver International，2015，35（Suppl.1）：121-128.

[13]Op den Brouw ML，Binda RS，van Roosmalen MH，et al. Hepatitis B virus surface antigen impairs myeloid dendritic cell function：a possible immuneescape mechanism of hepatitis B virus[J].Immunology，2009，126（2）：20-9.

[14]Jiang M，Broering R，Trippler M，et al.Toll-like receptor-mediated immune responses are attenuated in the presence of high levels ofhepatitis B virus surface antigen[J].Journal of viral hepatitis，2014，21（12）：860-872.

[15]Tharinger H，Rebbapragada I，Samuel D，et al.Antibody-dependent and antibody-independent uptake of HBsAg across human leucocyte subsets is similar between individuals with chronic hepatitis B virus infection and healthy donors[J].Journal of viral hepatitis，2017：1-8.

[16]Zhu D，Liu L，Yang D，et al.Clearing Persistent Extracellular Antigen of Hepatitis B Virus：An Immunomodulatory Strategy To Reverse Tolerance for an Effective Therapeutic Vaccination[J].Journal of Immunology，2016，196（7）.

編辑/成森