多氯联苯在两种海洋微藻中毒性效应及富集效应的研究

吴 越, 陈星星, 潘齐存, 郑伊诺, 胡 园, 王瑶华, 陆荣茂, 黄振华



多氯联苯在两种海洋微藻中毒性效应及富集效应的研究

吴 越, 陈星星, 潘齐存, 郑伊诺, 胡 园, 王瑶华, 陆荣茂, 黄振华

(浙江省海洋水产养殖研究所浙江省近岸水域开发与保护重点实验室, 浙江温州 325005)

通过分析2, 2', 3, 4, 4', 5'-六氯联苯(PCB138)对牟氏角毛藻()和亚心形扁藻()生长的影响, 以及PCB138对两种微藻超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性的影响, 研究多氯联苯对海洋微藻的毒性效应, 并采用气相色谱法研究了两种微藻对PCB138的生物富集效应。结果表明, PCB138对牟氏角毛藻和亚心形扁藻均有明显的毒性效应作用, 对2种藻类的96 h半抑制质量浓度(96hEC50)分别为0.057 mg/和0.354 mg/L, 与亚心形扁藻相比, 牟氏角毛藻对PCB138更敏感, 耐受性更差; 低浓度的PCB138对两种微藻SOD酶活性有诱导作用, 但当PCB138浓度过高时, SOD酶活性下降; 两种微藻对PCB138均有明显的富集作用, 随着培养时间的延长, 牟氏角毛藻中富集的PCB138含量呈上升趋势, 而亚心形扁藻中PCB138含量呈现先上升后下降趋势。

多氯联苯; 海洋微藻; 毒性效应; 生物富集

多氯联苯是一种典型的持久性有机污染物, 由联苯1-10位的氢原子被一个或多个氯原子取代后形成的一大类氯代烃类化合物的总称, 其同分异构体多达209种, 简称为PCBs(polychlorinated biphenyls)。多氯联苯具有低水溶性、高脂溶性的特征, 通过食物链的传递、富集及放大, 环境中被植物和水生生物吸收的PCBs的富集系数会达到数百万倍[1]。人类是食物链中的最高级消费者, PCBs的富集效应会导致人体受到最高浓度的毒害。已有研究表明, 多氯联苯可干扰生物体内分泌系统, 对神经系统、免疫系统和生殖系统等产生生理毒性[2-4]。2001年联合国在瑞典召开了环境大会并通过了《持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》, PCBs被列为首批消除的12种持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)之一[5]。

微藻是一种单细胞生物, 具有繁殖快、对毒物敏感等特点, 被广泛应用于水域环境污染的毒理研究[6-9]。在水域生态系统中, 微藻是PCBs进入食物链的起点, PCBs通过食物链被生物体吸收并在体内富集, 影响生物个体的健康水平, 进而对水域生态系统的健康构成威胁。藻类的种类、生物量及生长速率等因素均能影响PCBs的富集和迁移[10]。通过分析PCBs胁迫下藻类的生长、理化情况以及微藻对PCBs的富集能力, 可了解PCBs对藻类的毒性效应, 并为水域中多氯联苯污染的风险监测评估与生物防治提供实验基础。已经有有关该方面的报道, 聂湘平等探讨了多氯联苯对两种淡水藻类的生长的研究[11]; 方浩等[12]研究了多氯联苯对珠江口两种赤潮优势种的毒性效应。但对海洋微藻对多氯联苯的毒性胁迫应答和生物富集方面的研究和数据积累仍然不是很多。

本试验以两种常见的海洋饵料微藻牟氏角毛藻()和亚心形扁藻()为材料, 研究多氯联苯对其毒性效应以及其在藻体中的生物富集作用, 以期为多氯联苯对水生生态系统造成的生态风险评估及其控制治理提供数据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

藻种牟氏角毛藻()和亚心形扁藻()均为浙江省海洋水产养殖研究所实验室保存种; 培养微藻所用的海水采自浙江省温州市洞头县, 经醋酸纤维薄膜抽滤, 在 121℃灭菌 20 min待用; 试验所用多氯联苯为PCB138, 购买于上海百灵威化学技术有限公司, 纯度为 99.5%; 实验时先用丙酮助溶配成母液待用; SOD酶活检测试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 微藻培养方法

微藻用f/2培养基在光照培养箱中培养, 温度为25℃±0.5℃, 光照强度为2 500 lx, 光暗周期比为12 h︰12 h, 每日定时摇动3次并随机更换锥形瓶位置。

1.2.2 急性毒性试验

两种微藻培养至指数生长期, 按表1设置试验, 每个浓度设置3个平行, 并各设置对照组。在暴露于PCB138下0、24、48、72、96 h后, 每组取1 mL藻液, 在波长680 nm下测定微藻吸光度, 对照组微藻吸光值为参比0, 计算微藻生长相对抑制率= (0–)/0。96 h半效应浓度96h50计算参考李卓娜的概率单位-浓度对数法, 通过直线回归得到浓度效应方程, 当概率单位为5时, 计算96h50[13]。

表1 两种微藻急性毒性试验

Tab.1 Acute toxicity test of PCB138 in C. muelleri and P. subcordiformi

1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

PCB138各浓度组和对照组的两种微藻分别在处理0、24、48、72、96 h 后取样, 用试剂盒测定SOD酶活性。

1.2.4 两种微藻对PCB138富集作用

根据急性毒性试验结果设置低、中、高三组处理浓度和对照组, 在PCB138处理24、48、72、96、120 h后取藻液用0.45 µm滤膜过滤, 滤膜烘干至恒重, 按照国家标准GB 5009.190-2014[14]用气相色谱法测定微藻中PCB138的含量。

1.2.5 数据分析

试验结果用SPSS19.0和Excel进行数据分析和绘图。

2 结果与讨论

2.1 PCB138对两种微藻生长的影响

PCB138对牟氏角毛藻和亚心形扁藻的生长均有一定程度的影响。试验开始24 h后, 0.01 mg/L浓度PCB138处理下的牟氏角毛藻已开始出现显著生长抑制作用(<0.05), 0.1 mg/L浓度PCB138处理下的亚心形扁藻细胞生长相对于对照组也出现明显差异(<0.05); 随着培养时间的延长和处理浓度的升高, PCB138对两种微藻的抑制作用显著加强, PCB138与2种藻细胞增殖呈现出明显的剂量效应关系(图1)。细胞膜脂质过氧化引起的膜损伤是环境污染物抑制微藻生长的重要原因[15-16]。在本研究中, 在高浓度PCB138处理下, 观察发现两种藻液在后期沉淀增多, 扁藻藻液颜色发黄, 显微镜下观察发现两种微藻细胞碎片增多, 扁藻细胞聚集成团状, 细胞活动停滞, 说明随着PCB138处理浓度的升高和处理时间的延长, 微藻细胞的耐受能力达到极限, 细胞膜和叶绿体膜结构受损, 细胞生长增殖受到抑制(图2)。

由SPSS19.0进行分析计算得到PCB138对牟氏角毛藻的96hEC50为0.057mg/L, 对亚心形扁藻的96hEC50为0.354mg/L。根据《新化学物质危害评估准则(HJ /T154-2004)》[17]提出的评判标准(极高毒性物质: EC50(mg/L)<1; 高毒性物质: 1

2.2 PCB138对微藻SOD酶活性的影响

PCB138暴露24 h和48 h后, 0.10 mg/L和0.12 mg/L浓度处理组牟氏角毛藻SOD酶活性极显著上升(<0.01), 而0.01、0.05和0.075 mg/L组未出现诱导升高效应; PCB138暴露72 h后, 0.01 mg/L组牟氏角毛藻与对照组相比SOD酶活性没有明显提高, 而0.05 mg/L组SOD酶活性出现极显著的诱导效应(<0.01), 且随着PCB138浓度的继续升高SOD酶活性上升, 在0.75 mg/L时达到最高, 之后开始下降。PCB138暴露96 h后SOD酶活性随PCB138浓度变化趋势与72 h情况相似。在整个试验过程中, 0.01、0.05和0.075 mg/L组牟氏角毛藻的SOD活性随着暴露时间的延长逐渐上升, 而0.10 mg/L和0.12 mg/L组牟氏角毛藻SOD活力随着时间的延长先升高, 在处理后期则有所下降(图3A)。

PCB138暴露24 h后, 各浓度处理组的亚心形扁藻与对照组相比未出现显著差异(>0.05)。PCB138暴露48 h后, 0.1 mg/L和0.2 mg/L浓度组SOD酶活性有所升高, 但与对照组差异不显著(>0.05), 而0.3、0.4和0.5 mg/L浓度组SOD酶活性均有极明显升高(<0.01)。PCB138暴露72 h后, 各处理组亚心形扁藻与对照组相比SOD酶活性均有升高, 整体上随着PCB138浓度的升高SOD酶活性上升, 在0.3 mg/L时达到最高, 之后开始下降。其中0.1mg/L、0.1mg/L和0.3mg/L浓度组呈现极显著诱导效应(<0.01), 0.4 mg/L浓度组酶活力显著上升(<0.05), 0.5 mg/L浓度组酶活力也有升高但与对照组差异不显著(>0.05)。PCB138暴露96 h后0.1 mg/L浓度组亚心形扁藻SOD酶活性极显著上升(<0.01), 但随着PCB138浓度的继续升高, SOD酶活性开始下降, 0.4 mg/L和0.5 mg/L浓度组SOD酶活受到抑制。整个试验过程中, 0.1、0.2 mg/L组牟氏角毛藻的SOD活性随着暴露时间的延长逐渐上升, 而0.3、0.4和0.5 mg/L组牟氏角毛藻SOD活力随着处理时间的延长先升高, 在处理后期则受到抑制(图3B)。

*和**分别表示在0.05和0.01水平上差异显著

* and ** indicate differences at the 0.05 and 0.01 levels, respectively

在低浓度PCB138作用下, 牟氏角毛藻和亚心形扁藻SOD酶力均呈现一定的应激活性, 当PCB138浓度过高时, 微藻的SOD酶活性开始下降, 甚至受到抑制作用。这与聂湘平等[11]研究PCB1254对蛋白核小球藻和斜生栅藻SOD活性影响、李娜等[18]研究了PCB169对蛋白核小球藻和斜生栅藻, 孟范平等[20]研究BDE-47对4种海洋微藻抗氧化酶活性的影响得到的结果相类似, 即低浓度的PCB138可诱导微藻SOD酶活性, 当PCB138浓度过高时, 微藻SOD酶活性受到抑制。在低浓度多氯联苯的作用下, 微藻细胞产生的活性氧自由基增加, 微藻细胞在这种逆境胁迫下产生更多的SOD酶清除自由基以抵御多氯联苯对细胞的毒性作用。当多氯联苯浓度超过微藻耐受极限时, 微藻细胞受到损伤, 其体内的活性氧防御系统遭到破损, 则SOD酶活性受抑制。

2.3 两种微藻对PCB138的富集作用

在0.01 mg/L浓度PCB138处理下, 牟氏角毛藻中PCB138含量随培养时间的延长略有上升, 而0.05 mg/L和0.12 mg/L浓度PCB138处理下牟氏角毛藻中PCB138含量随培养时间的延长显著升高。三组浓度的牟氏角毛藻均在120 h时达到最大值, 分别为0.026、0.172、0.187 mg/g(图4A)。在0.1、0.3和0.5 mg/L三组浓度PCB138处理下, 亚心形扁藻中PCB138含量均呈现先上升后下降的趋势。0.1 mg/L和0.3 mg∙L浓度PCB138处理下的亚心形扁藻在72 h藻体中PCB138含量达到最高值, 分别为0.206 mg/g和0.395 mg/g。0.5 mg/L浓度PCB138处理下的亚心形扁藻在48h藻体中PCB138含量达到最高值0.354 mg/g(图4B)。两种微藻对PCB138都有明显的生物富集作用。

微藻对有机物的富集是一个复杂的生化过程, 在短期内以生物吸附为主[21]。生物吸附可以分为两个阶段: 第一阶段以物理吸附为主, 吸附过程进行得较快, 主要发生在细胞壁表面; 第二阶段以化学吸附为主, 在这一阶段被吸附物质可以通过主动运输进入细胞内部, 这个过程中需要消耗细胞新陈代谢所产生的能量, 进行得较慢[22]。牟氏角毛藻在PCB138处理下, 其富集作用随着PCB138质量浓度升高而增强, 且随着实验时间的延长, 各组牟氏角毛藻中PCB138含量均有所升高, 其升高速率呈现先快后慢的趋势。这与石瑛等[23]研究角毛藻对有机污染物1, 4-二氯苯富集作用的结果类似。而亚心形扁藻在0.1 mg/L浓度和0.3 mg/L浓度的PCB138处理下, 其藻体中 PCB138含量均呈现先上升后下降的趋势, 在0.5 mg/L浓度的PCB138处理下, 其藻体中PCB138含量随着实验时间的延长呈现下降的趋势, 这可能是与其吸附的PCB138量增多有关[19]。本实验结果表明, 牟氏角毛藻和亚心形扁藻对PCB138均有明显的富集作用, 这为两种微藻用于检测海水中多氯联苯环境污染提供了依据。

3 结论

PCB138对两种海洋微藻的生长均有明显的影响。随着处理浓度的增加和处理时间的延长, 两种微藻的生长抑制率升高。PCB138对两种藻类的生长作用呈现显著的剂量-效应关系。PCB138对两种微藻均有极高毒性, 亚心形扁藻对PCB138的毒性耐受性比牟氏角毛藻较要高。

在PCB138作用下, 两种微藻的SOD酶活性有较明显的变化。低浓度的PCB138对两种微藻SOD酶活性有诱导作用, 但当PCB138浓度过高时, 两种微藻SOD酶活性均受到抑制。

两种微藻对PCB138都有明显的富集作用。随着PCB138浓度升高, 牟氏角毛藻对PCB138的富集增强, 而亚心形扁藻对PCB138的富集作用则呈现先上升后下降的趋势。

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(本文编辑: 康亦兼)

A study of toxicity and bioaccumulation of PCBs in two species of marine microalgae

WU Yue, CHEN Xing-xing, PAN Qi-cun, ZHENG Yi-nuo, HU Yuan, WANG Yao-hua, LU Rong-mao, HUANG Zhen-hua

(Zhejiang Mariculture Research Institute, Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bioresource, Wenzhou 325005, China)

In order to investigate the toxicity effects of PCBs on marine microalgae, two algae species,andwere selected to study the effects of PCB138on growth and SOD enzyme activities. Meanwhile, the enrichment effects of PCB138onandwere analyzed by gas chromatography. The results showed that PCB138had obvious toxicity effects on the growth ofand96-h EC50of PCB138onandwere 0.057 mg∙L–1and 0.354 mg∙L–1, respectively, which indicated thatshowed more sensitivity and poorer tolerance to PCB138than. SOD activities in two microalgae cells were greatly induced by low levels of PCB138, and reduced as the PCB138concentrations increased above threshold values. Both of the algae species had strong capabilities to accumulate PCB138. The adsorption amount of PCB138inincreased with increasing cultivation time, while the amount of PCB138adsorbed infirst increased, then decreased.

polychlorinated biphenyls (PCBs); marine microalgae; toxicity effect; bioaccumulation

Mar. 2, 2016

[Opening fund of Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-Resource, NO. (J2013010); Public technologyresearch and agricultural project of Zhejiang Province, NO. (2014C32079); Scientific technology project of Zhejiang Province, NO. (2015F30021)]

X171.5

A

1000-3096(2017)03-0061-07

10.11759/hykx20160302004

2016-03-02;

2016-05-12

浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金项目(J2013010); 浙江省公益技术研究农业项目(2014C32079); 浙江省科技计划项目(2015F30021)

吴越(1984-), 女, 浙江温州人, 硕士研究生, 助理研究员, 研究方向为渔业生理生化, 电话: 0577-88231983, E-mail: wuy198412@ aliyun.com; 黄振华, 通信作者, E-mail: huangzhenhua0112@163.com