白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响探讨

鲁统斌，高存良，郭璟璟

（山东省莒南县人民医院，山东 临沂 276600）

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响探讨

鲁统斌，高存良，郭璟璟

（山东省莒南县人民医院，山东 临沂 276600）

目的探讨分析白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞（HOK，human oral keratinocytes）凋亡和增殖的影响。方法选取2015年8月-2016年8月期间我院66例体检健康者颊黏膜，对HOK进行培养，于菌丝型和孢子型白色念珠菌中加入制备的HOK，并分组，前者作为菌丝组，后者作为孢子组，而对照组则为单纯HOK，通过对比研究的方式，探讨白色念珠菌对HOK产生的影响。结果菌丝组凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI与对照组、孢子组对比（P<0.05），而孢子组与对照组在凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI方面对比，差异不明显（P>0.05）。结论HOK的增殖和凋亡与白色念珠菌有着密切关系，其能够引起HOK在调往率方面表现出升高的趋势，改变HOK增殖周期。

人口腔黏膜上皮角质细胞；白色念珠菌；凋亡；增殖

0 引言

白色念珠菌（Monilia albican），存在于健康者时，并不会导致其发生疾病，但是，存在于菌群之间的制约性失调或者免疫能力降低的人体，可诱发相应疾病，有较强的致病性[1]，而对于口腔念珠菌病而言，病原菌中最为主要的则是白色念珠菌，同时，疾病具有反复不愈的特点，对人类健康生活造成影响，而HOK作为白色念珠菌侵袭的防御点[2]，目前临床上对白色念珠菌对于HOK产生的作用研究报道较少，因此，本文则通过探讨白色念珠菌对HOK增殖与凋亡造成的影响，内容汇报如下：

1 材料与方法

1.1 材料

由中科院微生物研究所提供白色念珠菌标准菌株（ATCC 11006）、HOK（体检健康者，均为自愿提供，提取前未服用过药品）、广州市齐云生物技术有效公司生产的SDA（沙堡葡萄糖琼脂培养基）、FBS（胎牛血清）、YPD固定培养基（沙堡琼脂培养基干粉）、YPD液体培养基（沙堡液体培养基干粉），其余材料由我院实验室提供。

1.2 方法

（1）白色念珠菌[3]：于SDA中完成对ATCC 11006的培养，进行三次转种，根据0.5麦式浊度=106CFU/ml的标准，对致病菌配置为悬浮液，而配置浓度则为3×105CFU/ml。（2）菌丝型白色念珠菌：将配置的白色念珠菌置于RPMI 1640培养基（pH：7.0、10%FBS）中进行培养，于温度为37℃的情况下，以静止的方式，进行3小时的培养，从而将菌丝型白色念珠菌诱导出。（3）孢子型白色念珠菌[4]：应用划线法的方式，将配置的白色念珠菌接种于YPD固体培养基，于37℃的温度下，将乳白色奶油状菌落，于离心管（15ml）中装入YPD液体培养基，再将菌落转种于离心管（转速：200r/min、时间：18h、温度：37℃），从而完成得到孢子型白色念珠菌的操作。（4）HOK[5]：严格按照无菌操作，对体检健康者颊粘膜进行切取，清洗则应用PBS，实施11-12h的消化操作，从而得到上皮层，之后对其进行3次漂洗操作后，混合消化液（0.02%EDTA:0.05%胰蛋白酶=1:1），进行离心操作，置于培养箱（5%、37%二氧化碳饱和湿度细胞培养箱），待细胞生长融合情况，达到80%培养皿时，实施传代的培养操作，而本文实验应用第二代细胞。（5）实验分组：选取2015年8月-2016年8月期间我院66例体检健康者颊黏膜，对HOK进行培养，其中男性34例、女性32例；年龄18-42岁、平均年龄（30.2±5.1）岁；HOK培养2d后，将培养液去掉，细胞贴壁，实施PBS3次清洗后，分为对照组、菌丝组、孢子组。

1.3 观察指标

周期细胞：G2/M期、S期、G0/G1期；PI（细胞增殖指数）：PI=[（S+G2/M）/G0/G1+S+G2/ M]×100%[6]；细胞凋亡率。

1.4 统计学方法

2 结果

菌丝组凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI与对照组、孢子组对比（P<0.05），而孢子组与对照组在凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI方面对比（P>0.05），详见表1：

表1 三组观察指标结果对比

表1 三组观察指标结果对比

注释：^与对照组、孢子组对比，^P<0.05，*与对照组对比，*P>0.05。

组别凋亡率（%）周期细胞PI G0/G1期S期G2/M期菌丝组3.88±0.37^35.01±5.22^9.25±2.03^19.85±2.16^45.98±2.86^孢子组2.15±0.52*47.35±6.30*6.37±1.45*13.49±2.39*25.52±3.16*对照组1.75±0.1350.31±5.255.78±1.1911.39±2.1622.50±2.79

3 讨论

白色念珠菌是临床上的一种真菌，常常于阴道、上呼吸道、口腔等中存在，可通过大量的繁殖、将生长形式改变为芽生菌丝相，从而对细胞进行侵袭，引发疾病，而菌丝型、孢子型是白色念珠菌的两种形态，后面一种形态可向菌丝型转化，可通过对口腔黏膜上皮的黏附、侵袭及破坏作用，损伤HOK，最终导致患者发生口腔念珠菌病。细胞凋亡在临床上又被称之为细胞程序化死亡，与细胞坏死相反，过程具有主动性，常常于肿瘤发展、组织退化等中存在，对基因可发挥调控、表达、激活等作用，而在口腔黏膜一些病损组织中有胶样小体，因此，口腔病变、细胞凋亡，两者之间有着相关性，细胞增殖的方式为分裂，是生物体发育、生长、遗传、繁殖基础，而口腔黏膜癌前病变与口腔黏膜上皮出现异常增生现象有着关联性。细胞周期可分为M期、G1期、S期、G2期、G0期，其中S期表示DNA的合成期，通过情况下，G2/M期比例比较高，而S期细胞繁殖比较旺盛，而PI表明细胞增殖情况，反应出细胞繁殖能力[7-8]，而从本文表1研究结果可知，在HOK细胞增殖中，菌丝型白色念珠菌具有促进的作用，分析其中的机制可能是由于细胞从G1期转变为S期，从而使DNA合成方面加速，最终导致S期、G2/M期细胞百分数表现出显著增高的情况，从而也就有菌丝组PI显著高于对照组和孢子组（P<0.05）的结果，而菌丝组细胞凋亡率明显比对照组和孢子组高（P<0.05），提示，在HOK毒性方面，菌丝性白色念珠菌优于孢子型，能够将HOK凋亡加快。

综上所述，菌丝型白色念珠菌对HOKG0/G1期细胞百分数的下降、S期、G2/M期细胞百分数的升高具有诱导作用，能够使HOK周期细胞发生改变，因而，菌丝型白色念珠菌能够使细胞增殖指数增高，同时，对HOK凋亡率上升具有诱导的作用，因此，临床针对口腔念珠病患者进行治疗时，可通过对菌丝型白色念珠菌的控制，选取治疗方案和判断疗效。

[1] 仵楠,代海涛,徐江,等.维吾尔族高龋儿童口腔中白色念珠菌基因分型研究[J].实用口腔医学杂志,2016,32(2):252-255.

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[3] 孙富丽,张英,闻妍,等.白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的黏附作用及影响因素研究[J].中国实用口腔科杂志,2015,8(6):350-354.

[4] 魏美荣,李国菊,张达,等.角质细胞生长因子对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用研究[J].华西口腔医学杂志,2013,31(6):565-568.

[5] 杨卫明,吴春荣,许群欢,等.共同感染对白色念珠菌感染状态的影响研究[J].中华急诊医学杂志,2016,25(4):423-428.

[6] 钱雅洁,蒋文晖,王翔,等.白色念珠菌白斑中核苷酸结合寡聚化结构域1、核因子κB及人β-防御素的表达[J].中华口腔医学杂志,2014,49(8):464-469.

[7] 蒋文晖,王文梅,王翔,等.白色念珠菌感染对口腔白斑中RIP2和Caspase－12表达的影响[J].临床口腔医学杂志,2015,31(8):469-472.

[8] 耿芳惠,孙红英,王夏夏,等.白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响[J].现代生物医学进展,2016,16(2):209-211.

Effects of Candida albicans on apoptosis and proliferation of human oral mucosal epithelial cells

LU Tong-bin,Gao Cun-liang,GUO Jing-jing
(The People's Hospital of Junan County , Linyi, Shandong, China)

Objective:To study the analysis of candida albicans to human oral mucosal epithelial keratinocytes (HOK, human oral keratinocytes) apoptosis and proliferation. SelectionMethodsAugust 2015 - August 2016 during physical examination in 66 cases healthy buccal mucosa, to cultivate HOK, the hyphae and spores add preparation HOK, candida albicans and grouping, the former as hyphae group, the latter as the spore group, while the control group for pure HOK, through the way of comparative study, discusses the impact of candida albicans to HOK.ResultsApoptosis rate of mycelia group, G0 / G1 phase and S phase and G2 / M phase, PI, spore group compared with control group (P<0.05), while the spore group and control group in the apoptosis rate, G0 / G1 phase and S phase and G2 / M phase contrast, PI, no significant difference (P>0.05).ConclusionThe proliferation and apoptosis of HOK has close relationship with candida albicans, it can cause HOK in transferred to rate showed a rising trend, change the HOK proliferation cycle.

Oral mucosa epithelial keratinocytes; Candida albicans. Apoptosis; Proliferation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.05.71