重构Ⅰ型胶原联合聚天冬氨酸在仿骨生物矿化中的应用

张 展，张 春，郭峭峰，马苟平，沈立峰，俞华军，林炳远，鲁 宁，黄 凯

浙江省立同德医院骨科，杭州 310012



·论 著·

重构Ⅰ型胶原联合聚天冬氨酸在仿骨生物矿化中的应用

张 展，张 春，郭峭峰，马苟平，沈立峰，俞华军，林炳远，鲁 宁，黄 凯

浙江省立同德医院骨科，杭州 310012

目的 重构Ⅰ型胶原联合聚天冬氨酸制备仿生物骨。方法 采用酸解方法将鼠尾Ⅰ型胶原蛋白分解成原胶原纤维，然后置于钙磷矿化液中，在戊二醛交联下，重构组装成胶原纤维，并将钙磷晶体包裹在胶原纤维内部进行生物矿化。加入聚天冬氨酸，促进羟基磷灰石钙前体渗入胶原纤维内部，模仿人体内的骨生物矿化。矿化3 d和9 d，采用透射电子显微镜和电子衍射观察骨生物矿化过程。结果 透射电子显微镜和电子衍射结果显示，矿化3 d，羟基磷灰石钙前体被包裹在胶原纤维内部，胶原纤维部分矿化；矿化9 d，羟基磷灰石前体完全渗入胶原蛋白纤维内部，其无定型磷酸钙状态最终转变成羟基磷灰石晶体，从而模拟完成骨生物矿化，形成Ⅰ型胶原蛋白/羟基磷灰石钙的仿生骨材料。结论 重构Ⅰ型胶原联合聚天冬氨酸可制备出与人类自体骨组织化学成分和分子结构接近的仿生骨材料。

Ⅰ型胶原；重构；聚天冬氨酸；生物矿化

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：318-323

随着社会经济的发展，高速公路车祸、厂矿重大事故等高能量损伤导致的四肢粉碎性骨折越来越多，此类患者往往伴随骨缺损，选择适当的骨修复材料是治疗骨缺损的中心环节，目前一般采用自体骨移植、同种异体骨移植、人工骨移植。由于自体骨移植和同种异体骨移植均来自人类自身骨组织，数量有限。因此，为解决这一问题，国内外学者进行了大量的骨组织工程学研究，期待通过人工骨替代人类自体骨组织，如半水硫酸钙、磷酸三钙等多种骨陶瓷材料[1- 2]。然而，上述人工骨材料，无论是组织相容性，还是成骨生物活性，都比不上人类自身骨组织。这是因为，人类自身天然骨组织是由有机大分子Ⅰ型胶原蛋白和无机矿物质羟基磷灰石晶体生物矿化组成[3]。而上述人工骨材料无论化学成分，还是分子结构，均与人类自身天然骨组织相去甚远。所以，研发与人类自体骨组织化学成分、分子结构接近的骨移植材料显得尤为重要。天然骨组织是以Ⅰ型胶原蛋白为模板，羟基磷灰石晶体沿着Ⅰ型原胶原纤维生物矿化而成[4]。但是，原胶原纤维之间的间隙非常狭小，相邻平行排列纤维的间距只有0.24 nm[5]，羟基磷灰石晶体要镶嵌入如此狭小的原胶原纤维间隙进行矿化非常困难。本研究拟采用酸解方法将鼠尾肌腱分解成Ⅰ型原胶原纤维，将其置于钙磷矿化液和交联剂戊二醛中进行交联重构和生物矿化，Ⅰ型原胶原纤维在重构组装成Ⅰ型胶原纤维的同时，将羟基磷灰石钙前体包裹在重构后的Ⅰ型胶原纤维内部，并加入聚天冬氨酸，通过聚天冬氨酸促进羟基磷灰石钙前体再渗入胶原纤维内部，模仿骨生物矿化，以期制备一种与人类自体骨组织化学成分和分子结构接近的仿生骨材料。

材料和方法

主要材料和试剂 鼠尾、盐酸、1.67 mmol/L CaCl2溶液25 ml、9.5 mmol/L Na2HPO4溶液25 ml、400 mg/ml谷氨酸、0.05%戊二醛均购自上海阿拉丁科技股份有限公司，10 mg/ml聚天冬氨酸[(C4H5NO3)N：相对分子质量9 000～11 000]购自成都艾科达化学试剂有限公司。

酸解鼠尾Ⅰ型胶原的制备和检测 超净台操作取大鼠鼠尾洗净，75%酒精浸泡5 min；剪开，去掉皮毛，剪成小段，抽出银色肌腱，置于平皿中，灭菌生理盐水浸泡；在平皿中剪碎，按每克尾键50 ml比例加入0.1%醋酸溶液，摇晃，将尾腱分散于醋酸溶液中，4℃放置1周；4000 r/min(r=8 cm)离心20 min，在醋酸溶液的酸解下，尾腱可水解成胶冻状凝胶。取酸解胶原蛋白上清液20 μl加入4 ml 6×SDS上样缓冲液，95℃静置5 min，取10 μl进行SDS-PAGE电泳，检测酸解鼠尾Ⅰ型胶原的相对分子质量，并检测胶原蛋白浓度。

Ⅰ型胶原重构及检测 吸取制备的Ⅰ型胶原10 μl至小培养皿中，滴入0.05%戊二醛2 ml至小培养皿中浸泡胶原进行交联，将小培养皿置于恒温箱中静置24 h。Ⅰ型胶原可在交联剂戊二醛作用下进行重构，观察其宏观形态。

吸取制备的Ⅰ型胶原3 μl滴至镍网上；在小培养皿中放置合适大小滤纸，用水湿透后，将滴上胶原的镍网放置在滤纸上；吸取0.05%戊二醛0.5 ml滴至镍网胶原上，盖好盖子，在恒温箱中静置24 h。接着将镍网捞起，放在滤纸上干燥备用。然后将加载胶原的镍网，经去离子水、50%乙醇、100%乙醇依次漂洗后，放置在透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)下观察。

仿生骨生物矿化

钙磷矿化液的配制：取1.67 mmol/L CaCl2溶液5 ml倒入玻璃瓶中，滴加10 mg/ml聚天冬氨酸0.25 ml，再滴加400 mg/ml谷氨酸0.25 ml，然后缓慢倒入9.5 mmol/L Na2HPO4溶液5 ml，形成钙磷低过饱和溶液，pH值8.5。

胶原纤维重构和生物矿化：取原胶原纤维10 μl浸泡在10 ml钙磷矿化液中，随后滴入0.05%戊二醛2 ml进行胶原纤维重构同时进行生物矿化。每隔3 d换液1次，每次都先将旧的矿化液吸出，然后倒入新配置的矿化液。分别静置3、9 d，使重构胶原蛋白生物矿化，然后观察其宏观形态。

TEM观测和电子衍射：吸取3 μl胶原滴至镍网上，将加载胶原的镍网悬浮在10 ml矿化液上，然后滴入0.05%戊二醛2 ml。每隔3 d换液1次，每次都先将旧的矿化液吸出，然后倒入新配置的矿化液。分别静置3、9 d，采用TEM观测镍网上的矿化胶原并进行电子衍射。

结 果

鼠尾Ⅰ型胶原制备情况 鼠尾肌腱在醋酸溶液酸解下，腱性组织被水解成胶冻状溶液，分解为鼠尾Ⅰ型原胶原蛋白纤维。SDS-PAGE电泳检测结果显示，Ⅰ型原胶原蛋白纤维的相对分子质量在130 000～200 000间。胶原蛋白浓度为2.0 mg/ml，pH值为5。

原胶原纤维的重构情况 将酸解鼠尾Ⅰ型原胶原纤维进行重构组装，原胶原纤维重构成Ⅰ型胶原蛋白纤维，宏观表现为半透明果冻样胶体，具有一定生物力学强度，可用镊子夹起(图1)。将镍网上的重构胶原经乙酰双氧铀染色30 s，TEM下可见Ⅰ型原胶原纤维重构成的胶原纤维具有特征性明暗间隔周期性条纹结构，即D-Bank结构(图2)。

图 1 Ⅰ型原胶原纤维重构成胶原纤维，形成半透明果冻样胶体

Fig 1 Type Ⅰ collagen fibers constitute the collagen fibers，forming a translucent jelly-like gel

生物矿化情况

生物矿化3 d：胶体颜色逐渐加深至乳白色(图3)。镍网上的重构胶原矿化3 d后，TEM下可见Ⅰ型胶原纤维的明暗相隔周期性条纹结构，逐渐模糊；羟基磷灰石钙前体包裹在胶原纤维内部，胶原纤维部分矿化，羟基磷灰石钙晶核沿着胶原纤维矿化生长，鼠尾Ⅰ型胶原蛋白纤维忖度变深(图4)。电子衍射图结果显示，矿化早期，胶原纤维内部有磷酸钙纳米颗粒，从图中衍射环判断主要是无定型态(图5)。

TEM：透射电子显微镜

TEM：transmission electron microscope

图 2 TEM下可见，Ⅰ型胶原蛋白重构成胶原纤维，重构后的胶原纤维具有特征性D-Bank结构(×25 000)

Fig 2 TEM shows that typeⅠcollagen fibers constitute the collagen fibers with typical D-Bank structure(×25 000)

图 3 矿化3 d后，胶体呈微白色

Fig 3 Three days after mineralization，the colloid was slightly white

图 4 TEM下可见Ⅰ型胶原纤维的D-Bank结构模糊，忖度变深，部分矿化(×10 000)

Fig 4 TEM displays that the type Ⅰ collagen fiber has fuzzy structure and deeper contrast，along with partial mineralization(×10 000)

图 5 矿化早期，磷酸钙纳米颗粒包裹在胶原纤维内部，从图中衍射环判断主要是无定型态

Fig 5 In the early stage of mineralization，calcium phosphate nanoparticles were encapsulated in the inner side of the collagen fiber，the diffraction ring in the graph is mainly in the amorphous state

生物矿化9 d：胶体颜色加深至乳白色(图6)。镍网上的重构胶原矿化9 d后，TEM下可见Ⅰ型胶原纤维的明暗相隔D-Bank结构完全消失，鼠尾胶原蛋白纤维内部可见黑色羟基磷灰石晶体，嵌入胶原纤维纵向生长。当鼠尾Ⅰ型胶原纤维完全矿化时，由于整条胶原蛋白纤维都被羟基磷灰石晶体占据，胶原纤维呈现黑色(图7)。电子衍射图像结果显示，胶原矿化已经完成。强的衍射环提示，羟基磷灰石钙前体已经全部从无定型转化为结晶态，每个亮环对应1个晶面，依次是002、211、004(图8)。

图 6 胶原纤维矿化9 d后，颜色加深至乳白色

Fig 6 After 9 days of mineralization，the color is deepened to milky white

A. 矿化胶原放大20k倍的TEM图像；B. 矿化胶原放大80k倍的TEM图像

A. mineralized collagen (×20 000)；B. mineralized collagen (×80 000)

图 7 TEM下可见Ⅰ型胶原纤维的 D-Bank结构完全消失，羟基磷灰石晶体嵌入胶原蛋白纤维内部纵向生长，忖度加深至黑色

Fig 7 TEM reveals that the D-Bank structure of typeⅠcollagen fibers completely disappeared，the hydroxyapatite crystals were embedded into the collagen fibers and showed longitudinal growth，and the contrast became black

图 8 胶原的选区电子衍射图像显示，矿化9 d后，胶原矿化已经完成；强衍射环结果显示，磷酸钙矿物已经从无定型转化为结晶态，每个亮环对应1个晶面，依次是002、211、004

Fig 8 Selected area of the electron diffraction pattern of collagen reveals that：after 9 days of mineralization，the collagen mineralization was the strong diffraction ring shows that the amorphous calcium phosphate mineral has been transformed into crystalline state；each bright ring corresponds to one crystal plane，which is 002，211，and 004，respectively

讨 论

从天然骨组织的生物多级结构来看，它由Ⅰ型胶原蛋白和羟基磷灰石晶体生物矿化而成，其中Ⅰ型胶原蛋白最基本的单位为原胶原纤维，每条原胶原纤维是由3条α多肽链组成，相对分子质量为100 000～300 000，每5条原胶原纤维平行排列，组装成1根胶原微纤维，长300 nm，宽1.1 nm。在同一水平面上，每2条原胶原纤维首尾相接，首尾之间间距40 nm，形成了胶原纤维的空腔区；而上下每2条原胶原纤维错位1/4.5分子长度，其原胶原纤维重叠的区域形成了重叠区，长度约27 nm，从而形成67 nm具有周期性横纹的胶原微纤维[6- 7]；在重叠区，相邻的两条平行排列原胶原纤维的间距非常小，只有0.24 nm。

增加原胶原纤维间空隙最直接的方法是打开原胶原纤维间的化学键联系，将胶原微纤维水解成原胶原纤维。在这种水解状态下，原胶原纤维间没有空间限制，钙磷矿化液可以肆意地在原胶原纤维上形成羟基磷灰石晶体的晶核。然后再重构胶原蛋白，原胶原纤维一边组装成胶原微纤维，一边将羟基磷灰石晶体前体以及晶核包裹在胶原纤维间隙。接着再进行矿化，羟基磷灰石晶体就能在胶原纤维内充分生长。但是打开原胶原纤维间的化学键联系时，一定要在保持胶原分子三螺旋结构稳定性的前提下进行；因为只有具有三螺旋稳定结构的胶原蛋白分子，才可以通过其α1链在N末端肽的第9位置处的醛基与相邻α2链的第930位置处的羟赖氨酸残基形成Aldol醇醛键[9]，从而重叠组装成Ⅰ型胶原蛋白纤维。故本研究采取的方法是酸解胶原，利用低浓度酸性条件分解胶原分子间的希夫碱键和盐键，将失去交联的原胶原纤维溶解出来提取胶原[10]。因为醋酸可水解胶原分子间的希夫碱键和盐键，而且不会破坏Ⅰ型胶原分子的三螺旋结构，可保持Ⅰ型胶原分子的结构稳定性。只要Ⅰ型胶原分子的三螺旋结构仍然存在，原胶原纤维分子经过重构组装，仍然可以组装成胶原纤维。本研究结果显示，经酸解提取的鼠尾Ⅰ型胶原蛋白的相对分子质量在130 000～200 000间，而具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白相对分子质量也在100 000～300 000间，提示本研究酸解的Ⅰ型胶原是符合具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白。此外，TEM下可见经过重构组装后的酸解Ⅰ型胶原所形成的胶原纤维具有胶原蛋白纤维所特有的D-Bank结构，也从另一个角度证实酸解鼠尾Ⅰ型胶原不影响胶原分子的三螺旋结构，保持了分子结构的稳定性，所以胶原蛋白分子可以重构成Ⅰ型胶原特有的D-Bank结构纤维。

本研究将鼠尾Ⅰ型胶原酸解成原胶原纤维分子后，置于钙磷矿化液中，然后加入戊二醛交联进行生物矿化，结果显示，在矿化早期，TEM下可见羟基磷灰石钙前体被包裹在胶原纤维内部，胶原纤维部分矿化，羟基磷灰石钙晶核沿着胶原纤维矿化生长，鼠尾Ⅰ型胶原蛋白纤维忖度变深，胶体的颜色逐渐加深至乳白色。由于在游离的原胶原纤维分子重构组装成胶原纤维时，随着原胶原纤维分子间的间隙变小，部分羟基磷灰石前体可被挤出胶原纤维内部。因此为使羟基磷灰石能够充分矿化到胶原纤维内部，本研究还在钙磷矿化液中加入高分子聚合物聚天冬氨酸。根据聚合物诱导液晶前体理论，羟基磷灰石晶体最初并不是以固体形成，而是先在胶原蛋白纤维表面形成羟基磷灰石前体，即无定型磷酸钙(amorphous-calciumphosphate，ACP)。而聚天冬氨酸则可以将ACP稳定在饱含水分子的无定型状态，由于ACP含有大量水分子，以至于其无定型状态类似液晶态。类液晶态的ACP能通过毛细管作用，渗入至胶原纤维内部，转化为沿胶原纤维长轴平行排列的羟基磷灰石晶体[11]。Beniash等[12]通过拉曼光谱也证实，在小鼠牙釉质的生物矿化过程中存在着磷酸钙晶体的前体，即ACP状态。同样，在小鼠颅骨和长骨生物矿化过程中，也发现了ACP；即在骨生长过程中，成骨细胞先释放出ACP，ACP再透入胶原内部，然后转化为羟基磷灰石[13]。所以本研究就是通过加入聚天冬氨酸化模仿了天然骨组织的生物矿化。

本研究TEM和电子衍射结果显示，在刚开始矿化3 d时，胶原纤维是部分矿化的，磷酸钙矿物以无定型状态存在。随着时间推移，生物矿化继续深入，ACP矿物持续渗入胶原纤维内部；当胶原矿化到第9天时，胶原纤维基本已全部矿化，ACP已经转化为羟基磷灰石晶体。而羟基磷灰石晶体与胶原纤维之间的生物矿化结合，正是仿生了人类自身骨组织的化学成分和分子结构。

综上，本研究通过酸解鼠尾胶原，在保证其三螺旋结构稳定性的情况下，打开原胶原纤维之间的分子间隙；一边将原胶原纤维重构组装成Ⅰ型胶原蛋白，一边将钙磷晶核包裹在胶原内部生物矿化。而且通过加入聚天冬氨酸，将羟基磷灰石晶体稳定在ACP钙状态，渗入胶原纤维间隙内部，模拟了人体内骨生物矿化，最后形成Ⅰ型胶原蛋白/羟基磷灰石仿生骨材料。由于此仿生骨材料在化学成分和分子结构接近天然骨组织，有望取代自体骨移植，为其在临床上进一步应用研究打下基础。

[1]张展，张春，郭峭峰，等. 载万古霉素硫酸钙治疗骨髓炎的临床研究[J].中国医学科学院学报， 2013，35(3)：337- 342.

[2]王文波，陈中伟，陈统一，等. 自固化磷酸钙人工骨的最新研究进展[J]. 中国生物医学工程学报，2001，20(5)：473- 477.

[3]Olszta MJ，Cheng X，Jee SS，et al. Bone structure and formation：A new perspective[J]. Mater Sci Eng R Rep，2007，58(3)：77- 116.

[4]Nudelman F，Lausch AJ，Sommerdijk NA，et al.Invitromodels of collagen biomineralization[J]. J Struct Biol，2013，183(2)：258- 269.

[5]Habraken WJ，Tao J，Brylka LJ，et al. Ion-association complexes unite classical and non-classical theories for the biomimetic nucleation of calcium phosphate[J]. Nat Commun，2013，4(2)：1507- 1518.

[6]Liu Y，Kim YK，Dai L，et al. Hierarchical and non-hierarchical mineralisation of collagen[J]. Biomaterials，2011，32(5)：1291- 1300.

[7]Toroian D，Lim JE，Price PA. The size exclusion characteristics of type Ⅰ collagen：implications for the role of noncollagenous bone constituents in mineralization[J]. J Biol Chem，2007，282(31)：22437- 22447.

[8]Deshpande AS，Beniash E. Bio-inspired synthesis of mineralized collagen fibrils[J]. Cryst Growth Des，2008，8(8)：3084- 3090.

[9]Noitup P，Morrissey MT，Garnjanagoonchorn W.Invitroself-assembly of silver line grunt type Ⅰ collagen：effect of collagen concentrations，pH and temperatures on collagen self-assembly[J]. J Food Biochem，2006，30(5)：547- 555.

[10]Zhang JJ，Duan R，Tian Y，et al. Characterisation of acid-soluble collagen from skin of silver carp[J]. Food Chem，2009，116(1)：318- 322.

[11]Gower LB，Odom DJ. Deposition of calcium carbonate films by a polymer-induced liquid-precursor (PILP) process[J]. J Crystal Growth，2000，210(4)：719- 734.

[12]Beniash E，Metzler RA，Lam RS，et al. Transient amorphous calcium phosphate in forming enamel[J]. J Struct Biol，2009，166(2)：133- 143.

[13]Mahamid J，Sharir A，Gur D，et al. Bone mineralization proceeds through intracellular calcium phosphate loaded vesicles：a cryo-electron microscopy study[J]. J Struct Biol，2011，174(3)：527- 535.

Application of Recombinant Collagen Type Ⅰ Combined with PolyasparticAcid in Biomimetic Biomineralization

ZHANG Zhan，ZHANG Chun，GUO Qiaofeng，MA Gouping，SHEN Lifeng，YU Huajun，LIN Bingyuan，LU Ning，HUANG Kai

Department of Orthopedics，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310012，ChinaCorresponding author：GUO Qiaofeng Tel：0571- 89972356，E-mail：hzgqf@hotmail.com

Objective To prepare biomimetic bone material by reconstructing type Ⅰ collagen combined with polyaspartic acid. Methods By acid hydrolysis，rat tail type Ⅰ collagen was decomposed into collagen fibers，which were then placed in the calcium phosphate mineralization solution. Under the cross-linking of glutaraldehyde，the collagen fibers were reconstructed and assembled into collagen fibers，and the calcium phosphate crystals were wrapped in the inner side of the collagen fibers for biomineralizationin. After poly aspartate acid was added，calcium hydroxyapatite calcium precursor was added into the collagen fibers to simulate thebiomimetic biomineralizationin the human body. After mineralization for 3- 9 days，the bone mineralization process was observed by transmission electron microscopy and electron diffraction. Results Transmission electron microscopy and electron diffraction displayed that，after 3 days of mineralization，calcium hydroxyapatite precursor was wrapped in the collagen fiber gap，and the collagen fiber was partially mineralized. After 9 days of mineralization，calcium hydroxyapatite precursor completely infiltrated into the collagen fiber，and the amorphous calcium phosphate was transformed into hydroxyapatite calcium crystal. Thus，the simulation of bone mineralization was completed，and collagen type Ⅰ collagen/hydroxyapatite calcium biomimetic bone material was formed. Conclusion Reconstruction of type Ⅰ collagen combined with polyaspartic acid can prepare biomimetic bone material that has close chemical composition and molecular structure to the human bone tissue.

typeⅠcollagen；reconstruction；polyaspartic acid；biomineralization

浙江省科技厅院所专项基金项目(2013F50006)、浙江省科技厅公益技术研究社会发展项目(2014C33207)和浙江省医药卫生科技计划项目(2014KYA030) Supported by the Special Fund of the Science and Technology Department of Zhejiang Province (2013F50006)，the Public Welfare Project of the Science and Technology Department of Zhejiang Province (2014C33207)，and the Medical and Health Science and Technology Program of Zhejiang Province (2014KYA030)

郭峭峰 电话：0571- 89972356，电子邮件：hzgqf@hotmail.com

R318.08

A

1000- 503X(2017)03- 0318- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.004

2016- 11- 21)